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大鼠SUMO特异性蛋白酶1催化区蛋白制备及功能鉴定
文献摘要：
目的:制备大鼠SUMO特异性蛋白酶1(sentrin-specific protease,SENP1)催化结构域(SENP1C)蛋白,并鉴定其酶活性.方法:分别以大鼠SENP1-pcDNA3.1和EGFP-pcDNA3.1重组体为模板,PCR扩增目的基因,克隆入pGEM-T载体;酶切鉴定后,再亚克隆入原核表达载体pET-28a;阳性重组体导入原核表达细胞BL-21,异丙基硫半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白质表达;SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色鉴定蛋白质的表达.Ni-NTA吸附纯化蛋白质并透析处理,SDS-PAGE及考马斯亮蓝染色鉴定蛋白质的纯度;1 μmol/L及5 μmol/L Tat-EGFP分别孵育HT22细胞不同时间,荧光显微镜下观察细胞转染情况.采用5 μmol/L Tat-SENP1C预孵育HT22细胞10 h,免疫印迹检测整体蛋白质的SUMO化水平;用5 μmol/LTat-SENP1C预孵育HT22细胞或过表达Myc-Akt1和HA-SUMO1的HT22细胞10 h后,免疫沉淀和免疫印迹检测内源性和外源性 Akt1 与 SUMO1 的结合(SUMO 化).结果:Tat-SENP1C-pET-28a 和 Tat-EGFP-pET-28a 重组原核表达载体成功构建,IPTG可以诱导蛋白质高表达;采用Ni-NTA纯化和透析可获得较高纯度的蛋白质;5 μmol/L Tat-EGFP孵育HT22细胞10 h后,蛋白质穿膜效率较高;Tat-SENP1C重组蛋白可以显著降低HT22细胞中整体蛋白质的SUMO化以及内源性和外源性Akt1 SUMO化.结论:Tat-SENP1C-pET-28a和Tat-EGFP-pET-28a重组原核表达载体构建成功,且被IPTG诱导后可高效表达蛋白质;纯化的Tat-SENP1C蛋白具有较强的穿膜能力及酶活性.
文献关键词：
SUMO特异性蛋白酶1;催化结构域;原核表达载体;去SUMO化;蛋白激酶Bα
中图分类号：
作者姓名：
孟利;杜彩萍
作者机构：
徐州医科大学 江苏省脑病生物信息重点实验室 生物化学与分子生物学研究中心 徐州 221004
文献出处：
引用格式：
[1]孟利;杜彩萍-.大鼠SUMO特异性蛋白酶1催化区蛋白制备及功能鉴定)[J].中国生物工程杂志,2022(10):31-38
A类：
sentrin,SENP1C,LTat
B类：
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AB值：
0.216907
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