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稳定表达人源GABAAR-CHO细胞株的建立
文献摘要：
目的:构建α1亚基诱导表达、β2和γ2L亚基稳定表达的人源α1β2γ2L-GABAAR-CHO(Chinese hamster ovary)细胞株.方法:从人cDNA文库中扩增α1、β2、γ2L亚基编码基因,分别构建亚基表达载体;将三个亚基表达载体共转染CHO-K1细胞,通过抗性筛选、膜电位检测法进行稳定表达克隆筛选;通过qPCR、Western blot对亚基表达进行鉴定;以激动剂GABA、阳性变构调节剂地西泮(diazepam,Dia)、拮抗剂荷包牡丹碱(bicuculine)为工具药,采用全细胞膜片钳方法及膜电位检测法对稳定表达细胞的药理学功能进行鉴定.结果:经克隆筛选获得表达量较高的α1β2γ2L-GABAAR-CHO并对其亚基表达鉴定,结果显示该细胞稳定表达α1、β2、γ2L亚基,构建的α1β2γ2L-GABAAR-CHO细胞仅在加入四环素(tetracyclin)诱导的情况下表达α1亚基并与β2、γ2L组装成具有功能活性的α1β2-γ21-GABAAR;对其进行全细胞膜片钳检测研究发现,GABA可对其产生激动效应,引起α1β2γ2L-GABAAR-CHO细胞产生氯离子通道特征性电流变化,Dia可剂量依赖性地增强GABA对α1β2γ2L-GABAAR的激动效应;在膜电位检测研究中,获得GABA激动效应EC50为(177.72±15.92)nmol/L,Dia 变构效应 EC50为(3.63±0.52)μmol/L,拮抗剂 Bicuculine 拮抗效应IC50为(538.83±29.55)nmol/L.结论:通过采用诱导表达策略,成功构建了 a1β2γ2L-GABAAR-CHO稳定表达细胞株,该细胞株具有对激动剂、阳性变构剂、拮抗剂特异性检测的药理学功能.
文献关键词：
α1β2-γ2L-GABAAR-CHO;诱导表达;膜电位检测;GABA;地西泮
中图分类号：
作者姓名：
张毅;王陈;石晶晶;陈学军;张瑞华;靳倩;石童;李丽琴
作者机构：
国民核生化灾害防护国家重点实验室 北京 102205
文献出处：
引用格式：
[1]张毅;王陈;石晶晶;陈学军;张瑞华;靳倩;石童;李丽琴-.稳定表达人源GABAAR-CHO细胞株的建立)[J].中国生物工程杂志,2022(03):38-46
A类：
表达克隆,bicuculine,tetracyclin,Bicuculine
B类：
稳定表达,达人,GABAAR,CHO,细胞株,亚基,诱导表达,2L,Chinese,hamster,ovary,cDNA,文库,编码基因,表达载体,共转染,K1,抗性筛选,膜电位检测,检测法,qPCR,blot,激动剂,变构调节剂,地西泮,diazepam,Dia,拮抗剂,荷包牡丹碱,全细胞膜片钳,药理学,四环素,装成,有功,功能活性,氯离子通道,通道特征,特征性,电流变化,剂量依赖,量依赖性,EC50,nmol,构效,拮抗效应,IC50,表达策略,a1,特异性检测
AB值：
0.265769
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