典型文献
重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化
文献摘要：
目的:基于重叠延伸PCR(SOE PCR)技术构建转录因子EB(TFEB)丝氨酸114位点突变体原核表达质粒,并进行体外诱导表达和纯化.方法:根据SOE PCR技术原理设计突变引物,以pGEX-6p-1-TFEB质粒为模板,分别采用外侧引物F和R及突变引物Fn和Rn进行第1步PCR扩增,获得含突变位点的产物1和产物2.经第2步PCR退火延伸对产物1和产物2进行重叠拼接,以拼接后DNA片段为模板,采用外侧引物F和R进行第3步PCR扩增获得含突变位点的目的DNA;将其克隆至pGEX-6p-1载体,采用BamHⅠ和SalⅠ进行酶切鉴定,DNA测序验证突变结果.于大肠杆菌(E.coli)中分别采用不同浓度异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)在不同条件下诱导TFEB及其突变体重组蛋白表达.Glutathione-Sepharose 4B琼脂糖凝珠分离纯化蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化产物蛋白浓度和相对分子质量.结果:第1步PCR扩增获得均含有突变位点的2条DNA片段,经第2步PCR退火延伸和第3步PCR扩增后获得大量含有突变位点的完整DNA片段.双酶切鉴定,连接的DNA片段与目的片段大小一致.DNA测序显示TFEB的114位丝氨酸(TCT)成功突变为丙氨酸(GCT).在0.5 mmol·L-1 IPTG、16℃诱导过夜条件下获得TFEB及其突变体的可溶性蛋白表达.SDS-PAGE凝胶电泳,纯化后蛋白浓度较高,分子大小正确.结论:利用SOE PCR技术成功实现了TFEB丝氨酸114位点的定点突变,并且TFEB及其突变体基因在E.coli中成功表达.
文献关键词：
转录因子EB;重叠延伸PCR;定点突变;融合蛋白;丝氨酸;丙氨酸
中图分类号：
作者姓名：
焦凤娟;刘俊杰;卢思维;姜东君
作者机构：
济宁医学院精神卫生学院 山东省行为医学重点实验室,山东 济宁 272067
文献出处：
引用格式：
[1]焦凤娟;刘俊杰;卢思维;姜东君-.重叠延伸PCR技术定点突变TFEB原核表达载体的构建及体外诱导表达和纯化)[J].吉林大学学报（医学版）,2022(05):1109-1115
A类：
B类：
定点突变,TFEB,原核表达载体,体外诱导,诱导表达,SOE,技术构建,丝氨酸,位点突变,突变体,质粒,技术原理,原理设计,引物,pGEX,6p,Fn,Rn,突变位点,退火,拼接,BamH,Sal,大肠杆菌,coli,异丙基,半乳糖,糖苷,IPTG,不同条件下,重组蛋白表达,Glutathione,Sepharose,4B,琼脂糖,分离纯化,SDS,PAGE,凝胶电泳,纯化产物,蛋白浓度,相对分子质量,双酶,TCT,丙氨酸,GCT,过夜,可溶性蛋白,分子大小,融合蛋白
AB值：
0.311356
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