典型文献
山羊RORα基因的克隆、表达载体构建及功能分析
文献摘要：
旨在克隆山羊维甲酸相关孤儿受体α(RORα)基因并构建其真核表达载体,然后利用生物信息学工具系统分析RORα的生物学特性,最后对其在山羊生物钟系统中的作用机制进行初步探究.本研究以1只健康的12月龄雄性西农萨能奶山羊为试验动物,提取其肝组织总RNA,经逆转录PCR反转录为cDNA后,利用常规PCR扩增山羊RORα基因的编码区(coding sequence,CDS)片段,使用同源重组法将其与pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体相连接;重组载体经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gRORα;将 pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gRORα 质粒分别转染至 HEK293T 细胞后,通过实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白质免疫印迹(western blotting,WB)技术检测山羊RORα的表达;同时利用ExPASy、ProtScale等软件对山羊RORα基因进行系统的生物信息学分析.另外,使用同源重组法分别构建含有山羊生物钟基因BMAL1和NR1D1 启动子片段的 pGL4.10-BM AL1-Promoter-Luc 及 pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc 的荧光素酶报告质粒,并通过双荧光素酶报告试验探究山羊RORα蛋白调控BMAL1和NR1D1基因启动子转录活性的作用机制.PCR、酶切和测序鉴定结果表明,pcDNA3.1-3HA-gRORα重组质粒构建成功;qPCR和WB结果显示,pcDNA3.1-3HA-gRORα转染组RORα基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA转染组(P＜0.01).生物信息学分析结果显示,山羊RORα基因CDS区序列与绵羊、牛和猪的相似性较高,分别为97.5％、97.1％和95.2％.山羊的RORα蛋白是一种亲水性蛋白.二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,有信号肽的概率较小,无跨膜区;三级结构与小鼠和人的RORα蛋白差异性极小,三者具有高度相似性.此外,PCR、酶切和测序结果表明,pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc 和 pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc 重组质粒构建成功.双荧光素酶报告试验结果表明,山羊RORα蛋白可以显著上调山羊BMAL1和NR1D1基因启动子的转录活性.本研究成功构建了山羊RORα基因的真核表达载体,并证明了 RORα蛋白可以正向调控山羊BMAL1和NR1D1基因的启动子活性,这为进一步探究山羊核受体RORα的功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了前期基础.
文献关键词：
山羊;维甲酸相关孤儿受体α;真核表达载体;生物信息学分析;生物钟
中图分类号：
作者姓名：
高登科;赵泓淙;董浩;靳亚平;陈华涛
作者机构：
西北农林科技大学动物医学院,杨凌712100;西北农林科技大学农业农村部动物生物技术重点实验室,杨凌712100
文献出处：
引用格式：
[1]高登科;赵泓淙;董浩;靳亚平;陈华涛-.山羊RORα基因的克隆、表达载体构建及功能分析)[J].畜牧兽医学报,2022(06):1779-1794
A类：
3HA,gROR,pGL4,AL1
B类：
表达载体构建,功能分析,维甲酸,孤儿,真核表达载体,利用生物,生物信息学工具,生物学特性,月龄,西农萨能奶山羊,试验动物,肝组织,逆转录,编码区,coding,sequence,CDS,同源重组,pcDNA3,Puro,相连接,重组载体,转染,HEK293T,real,quantitative,qPCR,蛋白质免疫印迹,western,blotting,WB,ExPASy,ProtScale,生物信息学分析,生物钟基因,BMAL1,NR1D1,Promoter,Luc,双荧光素酶,试验探究,基因启动子,转录活性,重组质粒构建,蛋白表达水平,绵羊,亲水性,二级结构,无规则,卷曲,信号肽,三级结构,极小,启动子活性,核受体,转录调控机制
AB值：
0.217498
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