[目的]鉴定绵羊趋化因子C-C基序配体19(C-C motif chemokine ligand 19,CCL19)基因启动子的核心启动子区域和关键转录因子,探究该基因在转录调控方面的作用机制.[方法]选取绵羊CCL19基因5'-侧翼序列1 000 bp,PCR扩增启动子的7个不同长度的截短片段,并连接至pGL3-Basic质粒;将重组质粒与pRL-TK质粒共转染到293T细胞中,结合双荧光素酶报告基因检测系统分析不同截短片段的相对荧光活性.利用在线预测软件分析和筛选CCL19基因核心启动子区域内的转录因子结合位点.采用定点突变技术构建转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体,与pRL-TK质粒共转染到293T细胞,分析转录因子结合位点缺失质粒的相对荧光活性.[结果]成功构建了 7个不同长度(pGL3-P、pGL3-P1、pGL3-P2、pGL3-P3、pGL3-P4、pGL3-P5及pGL3-P6)的 CCL19基因启动子片段的荧光素酶报告载体;采用双荧光素酶报告基因检测系统鉴定出转录起始位点上游-256/-186 bp为CCL19基因启动子核心启动子区域,表明该区域对CCL19基因转录调控有重要作用.生物信息学分析预测到该区域存在 POU5F1(-201/-189 bp)、ZBTB26(-228/-217 bp)、FOXI1(-239/-228 bp)、GLI2(-255/-243 bp)和SP2(-219/-211 bp)5个转录因子的结合位点,并成功构建了转录因子结合位点缺失的荧光素酶报告载体.双荧光素酶报告基因检测系统分析显示,POU5F1转录因子的结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性极显著降低(P＜0.01),FOXI1、ZBTB26、SP2转录因子结合位点缺失后绵羊CCL19基因转录活性均极显著升高(P＜0.01).[结论]试验成功构建CCL19基因启动子荧光素酶报告载体,确定CCL19基因启动子的核心启动子区域为转录起始位点上游-256/-186 bp,并鉴定出转录因子POU5F1结合位点可能是CCL19基因转录的重要调控位点,为下一步研究绵羊CCL19基因在先天性免疫、适应性免疫和淋巴细胞迁移等方面的功能提供理论基础.

绵羊;CCL19基因;启动子;转录调控

翟哲;陈思;吴艳茹;王雪梅;李崇瑞;刘志勇;陈巧玲;王凤阳;杜丽;李昌;金宁一

海南大学动物科技学院,海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室,海口市动物基因工程重点实验室,海口 570228;军事医学研究院军事兽医研究所,长春130122

中国畜牧兽医

[1]翟哲;陈思;吴艳茹;王雪梅;李崇瑞;刘志勇;陈巧玲;王凤阳;杜丽;李昌;金宁一-.绵羊CCL19基因启动子活性分析及其转录调控元件筛选)[J].中国畜牧兽医,2022(04):1213-1222

ZBTB26,GLI2

绵羊,CCL19,基因启动子,启动子活性,活性分析,转录调控元件,趋化因子,基序,motif,chemokine,ligand,核心启动子,启动子区域,关键转录因子,侧翼序列,bp,同长,短片,pGL3,Basic,重组质粒,pRL,TK,共转染,293T,双荧光素酶报告基因,基因检测,光活性,在线预测,预测软件,转录因子结合位点,定点突变技术,技术构建,P1,P3,P4,P5,P6,系统鉴定,转录起始位点,子核,基因转录,生物信息学分析,分析预测,POU5F1,FOXI1,SP2,转录活性,先天性免疫,适应性免疫,细胞迁移

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