[目的]对羊口疮病毒(Orf virus,ORFV)ORFV114蛋白进行生物信息学分析、转录动力学、真核表达及亚细胞定位研究.[方法]使用DNAStar软件对ORFV-JS株ORFV114基因进行序列比对分析;分别使用在线网站ExPASy、TMHMM-2.0、SignalP-5.0、SOPMA、SWISS-MODEL 对 ORFV114 蛋白进行理化性质分析,以及跨膜区、信号肽、结构预测;在阿糖胞苷(cytarabine,Arac)存在或不存在的情况下,于ORFV感染HeLa细胞后多个时间点收获细胞,RT-PCR扩增ORFV114基因,确定ORFV114蛋白的动态转录水平;PCR扩增ORFV114基因,将其亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建pEGFP-ORFV114重组质粒,经酶切、测序鉴定正确后,经脂质体Lipofectamine 3000瞬时转染 HEK293细胞,通过 Western blotting鉴定ORFV114-EGFP融合蛋白的表达;将pEGFP-N1质粒和pEGFP-ORFV114重组质粒瞬时转染HeLa细胞,24 h后使用Hoechst 33342对细胞核染色,倒置荧光显微镜下观察ORFV114蛋白的亚细胞定位.[结果]ORFV-JS株ORFV114基因大小为1 041 bp,在ORFV毒株中高度保守;ORFV114蛋白包含346个氨基酸,预测分子质量大小为38 ku;ORFV114为弱亲水性不稳定蛋白,无跨膜区域,无信号肽;其二级结构由无规则卷曲、α-螺旋、延伸链和β-转角组成,分别占45.09％、25.14％、21.68％和8.09％;在Arac存在或不存在的情况下,ORFV114的转录在ORFV感染后2 h即可被检测到,且随感染时间的延长转录水平不断提高,即Arac并未抑制ORFV114转录,ORFV114为ORFV早期基因;成功构建了 pEGFP-ORFV114重组质粒,ORFV114-EGFP融合蛋白在HEK293细胞中成功表达,融合蛋白大小约65ku;ORFV114蛋白主要定位在HeLa细胞的细胞质中且呈点状分布.[结论]本研究成功地对ORFV114蛋白进行了转录动力学分析、真核表达及亚细胞定位,为进一步探索ORFV114蛋白功能及筛选互作蛋白奠定基础.

羊口疮病毒(ORFV);ORFV114蛋白;生物信息学分析;转录动力学;真核表达;亚细胞定位

庞峰;龙琴琴;梁绍波;成虹松;程振涛

贵州大学动物科学学院,贵阳550025;贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室,贵阳550025

中国畜牧兽医

[1]庞峰;龙琴琴;梁绍波;成虹松;程振涛-.羊口疮病毒ORFV114蛋白生物信息学分析、真核表达及亚细胞定位)[J].中国畜牧兽医,2022(11):4150-4158

ORFV114,转录动力学,Arac,65ku

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