[背景]非洲猪瘟(ASF)于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重.目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段.[目的]制备非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法.为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段.[方法]构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验(iELISA)鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法.[结果]通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD.纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1:102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性.经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测获得的8株单抗均具有良好的反应性.叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187-194aa.利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了 ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了 190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91％,总符合率为96.32％.[结论]本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187-194aa.并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑.

非洲猪瘟病毒;P30蛋白;单克隆抗体;抗原表位;阻断ELISA

张冯禧;肖琦;朱家平;尹力鸿;赵霞玲;严明帅;徐晋花;温立斌;牛家强;何孔旺

西藏农牧学院动物科学学院/西藏高原动物疫病研究自治区高校重点实验室,西藏林芝860000;江苏省农业科学院兽医研究所/农业农村部兽用生物制品工程技术重点实验室,南京210014

中国农业科学

[1]张冯禧;肖琦;朱家平;尹力鸿;赵霞玲;严明帅;徐晋花;温立斌;牛家强;何孔旺-.非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立)[J].中国农业科学,2022(16):3256-3266

194aa

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