目的:1,4-苯并二(噁)烷是普罗克生、多沙唑嗪等抗高血压和MCK-242等抗抑郁药物的手性中间体,在医药领域具有广泛应用.目前化学合成具有产量高的优势,然而存在环境污染和生产安全性低等问题.应用脂肪酶进行催化合成提供了 1,4-苯并二(噁)烷的绿色合成新途径.研究发现天然酶存在对映体选择性低的局限,因此针对南极假丝酵母脂肪酶B进行分子进化,并建立了 1,4-苯并二(噁)烷催化合成的技术路线.方法:首先,针对南极假丝酵母脂肪酶B活性中心参与底物结合和转化的关键氨基酸残基进行分析,并构建了相互作用位点协同进化的饱和突变库,通过HPLC检测,筛选获得了系列转化效率高和对映选择性强的突变体,最后对影响最佳突变体D223N/A225K催化效率的反应条件进行系统优化.结果:来自D223和A225位点突变体(D223N/A225 K和D223G/A225W等)偏向于合成(S)-型产物;而E188和I189位点突变体(E188D/I189M等)表现出偏向于合成(R)-型产物.与野生型相比,最佳突变体D223N/A225K合成(S)-1,4-苯并二(噁)烷的ees值从11.9％提升到29.3％.对反应条件系统优化后,突变体D223N/A225K在37℃、正丁醇/磷酸盐缓冲液(20∶80,V/V)两相溶剂中反应50 min后对底物(R,S)-1,4-苯并二(噁)烷-2-甲酸甲酯的转化率为(47.5±2.33)％,ees值达(93.9±0.16)％.结论:通过分子改造与条件优化,成功实现对(R,S)-1,4-苯并二(噁)烷-2-甲酸甲酯的高效动力学拆分,为蛋白质工程技术创制新酶提供了新例证,也为酶法高效催化合成(S)-1,4-苯并二(噁)烷类分子提供了理论和技术基础.

南极假丝酵母脂肪酶B;蛋白质工程;1;4-苯并二(噁)烷;手性拆分

张琦;唐璐瑶;何远志;张凯;祝加伟;崔莉;冯雁

上海交通大学生命科学技术学院 微生物代谢国家重点实验室 上海 200240

中国生物工程杂志

[1]张琦;唐璐瑶;何远志;张凯;祝加伟;崔莉;冯雁-.酵母脂肪酶分子进化及催化合成(S)-1,4-苯并二(噁)烷)[J].中国生物工程杂志,2022(07):35-44

普罗克,D223N,A225K,D223,A225,D223G,A225W,E188,I189,E188D,I189M,ees

脂肪酶,分子进化,催化合成,多沙唑嗪,抗高血压,MCK,抗抑郁药物,手性中间体,医药领域,化学合成,存在环境,生产安全,绿色合成,对映体选择性,南极,假丝酵母,活性中心,底物,氨基酸残基,协同进化,饱和突变,HPLC,转化效率,对映选择性,突变体,催化效率,反应条件,系统优化,位点突变,野生型,正丁醇,磷酸盐缓冲液,甲酸甲酯,分子改造,条件优化,动力学拆分,蛋白质工程,创制,例证,酶法,高效催化,技术基础,手性拆分

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