目的 克隆表达埃及伊蚊黄蛋白c(Aael-yellow-c)基因,并探讨rAael-yellow-c蛋白体外抗凝血作用.方法 RT-PCR扩增Aael-yellow-c成熟肽基因,纯化后的片段与pEASY-E1载体连接,转化至大肠埃希菌DH5α 感受态细胞,取菌液进行PCR、双酶切和测序鉴定.0.1 mol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导蛋白表达后,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况.比浊法观察不同浓度rAael-yellow-c蛋白对二磷酸腺苷诱导的血小板聚集活性影响.手工法检测不同浓度rAael-yellow-c蛋白对人血浆凝血酶原时间(PT)、部分凝血活酶时间(APTT)及凝血酶时间(TT)的影响.采用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析,组间差异比较采用t检验.结果 Aael-yellow-c基因CDS区为1287 bp,含27个氨基酸组成的信号肽,成熟肽序列长1200 bp,编码399个氨基酸.RT-PCR扩增获得Aael-yellow-c基因片段,大小约为1200 bp.菌液PCR、双酶切和测序鉴定显示,pEASY-E1-Aael-yellow-c质粒构建成功.SDS-PAGE结果显示,重组蛋白以包涵体形式表达;镍柱亲和层析纯化重组蛋白后获得单一条带.Western blotting结果显示,该蛋白可被His-tag抗体和抗rAael-yellow-c蛋白的兔血清多克隆抗体识别.血小板聚集抑制实验结果显示,2083.30、416.66、83.33、16.67和3.33 nmol/L rAael-yellow-c蛋白可抑制由ADP诱导的血小板聚集,差异具有统计学意义(t=7.09、10.39、5.39、10.54和8.93,P<0.01),其中3.33 nmol/L的重组蛋白对ADP诱导的血小板聚集抑制作用最强,抑制率为(59.27±11.90)％;0.67、0.13和0.02 nmol/L的重组蛋白对ADP诱导的血小板聚集作用无影响(t=2.10、1.33和0.00,P>0.05).内外源凝血实验结果显示,与阴性对照组相比,0.12、1.20和12.00μmol/L rAael-yellow-c分别作用于人血浆时,PT分别为13.63～14.10、13.32～14.38和13.55～16.01 s,差异无统计学意义(t=1.33、0.63和1.00,P>0.05);APTT分别为32.76～38.46、31.94～41.78和33.34～39.29 s,差异无统计学意义(t=0.47、0.06和0.24,P>0.05);TT分别为19.12～21.20、19.7～23.12和21.85～25.30 s,差异无统计学意义(t=0.47、0.24和1.60,P>0.05).结论 获得的rAael-yellow-c蛋白主要通过抑制ADP诱导的血小板聚集作用帮助蚊虫吸血.

埃及伊蚊;yellow-c基因;血小板聚集;抗凝血

张霞;颜凤;牟小会;林紫敏;聂映;程金芝;商正玲;吴家红

贵州医科大学寄生虫学教研室,贵安 550025;贵州医科大学基础医学院现代病原生物学特色重点实验室,贵安550025;遵义医科大学第三附属医院(遵义市第一人民医院)检验科,遵义 563099;贵州医科大学免疫学教研室,贵安 550025

中国寄生虫学与寄生虫病杂志

[1]张霞;颜凤;牟小会;林紫敏;聂映;程金芝;商正玲;吴家红-.埃及伊蚊黄蛋白c基因的克隆、表达及其体外抗凝血作用)[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2022(02):153-158,167

Aael,rAael,血小板聚集抑制作用

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