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副溶血弧菌耐热直接溶血素DAS-ELISA检测方法的建立
文献摘要：
目的 建立副溶血弧菌耐热直接溶血素的双抗体夹心ELISA(double antibody sandwich ELISA,DAS-ELISA)检测方法.方法 本研究通过PCR技术扩增副溶血弧菌耐热直接溶血素基因序列,并将其克隆至pET-28a载体后进行原核表达,对表达蛋白进行纯化和鉴定,随后用高纯度的重组蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,得到抗体后利用分子互作测定抗体的亲和力,并利用该抗体建立检测副溶血弧菌耐热直接溶血素的DAS-ELISA方法.通过棋盘法对该方法的反应条件进行优化,建立标准曲线,并对建立的DAS-ELISA方法进行性能评价及初步应用.结果 本实验制备的多克隆抗体亲和力可达1×10-8,使用该高亲和力抗体建立的DAS-ELISA方法灵敏度为78 ng/mL,定量范围为78～312 ng/mL;与创伤弧菌溶细胞毒素(Vibrio vulnificus hemolysin,VVH)、产气荚膜梭菌α毒素(Clostridium perfringens a toxin,CPA)以及产气荚膜梭菌ε毒素(epsilon toxin,ETX)均无交叉反应;利用扇贝、花蛤和魁蚶制备海鲜模拟样本,在上述3种模拟样本内添加重组蛋白构建标准曲线,评价本方法复杂基质中检出能力时发现灵敏度均并未发生改变;同时在上述3种模拟样本中添加菌液上清评价本方法检测天然毒素能力,检出率为100％.结论 成功构建了一种用于副溶血弧菌耐热直接溶血素检测的DAS-ELISA方法,该方法特异性强、灵敏度高,适用于复杂基质检测,有望开发成副溶血弧菌耐热直接溶血素快速诊断试剂盒,具有良好的应用前景.
文献关键词：
耐热直接溶血素;多克隆抗体;DAS-ELISA
中图分类号：
作者姓名：
白雪欣;胡宸艺;金志颖;万伟;李月;王菁;李岩伟;高姗;王景林
作者机构：
安徽医科大学基础医学院,合肥230032;军事科学院军事医学研究院微生物流行病研究所病原微生物生物安全国家重点实验室,北京100071
文献出处：
引用格式：
[1]白雪欣;胡宸艺;金志颖;万伟;李月;王菁;李岩伟;高姗;王景林-.副溶血弧菌耐热直接溶血素DAS-ELISA检测方法的建立)[J].中国人兽共患病学报,2022(08):666-672
A类：
VVH,魁蚶
B类：
副溶血弧菌,耐热直接溶血素,DAS,双抗,夹心,double,antibody,sandwich,溶血素基因,基因序列,pET,28a,原核表达,高纯度,重组蛋白,新西兰白兔,多克隆抗体,分子互作,棋盘法,反应条件,标准曲线,性能评价,初步应用,实验制备,抗体亲和力,创伤弧菌,细胞毒,Vibrio,vulnificus,hemolysin,产气荚膜梭菌,Clostridium,perfringens,toxin,CPA,epsilon,ETX,交叉反应,扇贝,海鲜,模拟样本,构建标准,复杂基质,检出能力,菌液,上清,法特,灵敏度高,质检,发成,快速诊断,诊断试剂,试剂盒
AB值：
0.310184
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