目的 本研究拟构建肌肉特异表达Cas9示踪同源打靶载体,为成肌细胞分化研究及肌肉特异表达Cas9小鼠模型制作奠定基础.方法 人工合成肌肉特异启动子SP,替换PX459载体中的CMV启动子,构建肌肉特异表达Cas9载体;载体在C2C12细胞中的编辑效率由XbaI和T7E1酶切检测;在此基础上通过同源重组引入DsRed红色荧光蛋白构建Cas9示踪载体;将示踪载体的SP-Cas9-DsRed部分连接至Rosa26位点左右同源臂之间,构建肌肉特异表达Cas9示踪重组载体;将该载体与PX459-Rosa26共转染至C2C12细胞并进行嘌呤霉素筛选,观察荧光的表达,同时,提取细胞DNA进行PCR鉴定和测序,检测载体在C2C12细胞中的整合情况.结果 酶切鉴定以及对目的片段的测序结果表明,成功构建了肌肉特异表达Cas9载体PX459-Rosa26-SP和肌肉特异同源打靶示踪载体Donor-Cas9-SP-DsRed;XbaI和T7E1酶切实验表明,PX459-Rosa26-SP在C2C12细胞中具有较高的编辑效率;转染后的C2C12细胞出现红色荧光,表明Donor-Cas9-SP-DsRed具有表达活性且在肌肉细胞中特异表达;PCR鉴定和测序结果表明,Donor-Cas9-SP-DsRed在C2C12细胞Rosa26位点成功整合.结论 成功构建了肌肉特异表达Cas9示踪同源打靶载体Donor-Cas9-SP-DsRed,在为肌肉特异表达Cas9小鼠模型制备提供载体基础的同时,也为肌肉相关基因疾病的研究与基因治疗提供了新的思路.

SP启动子;肌肉特异表达;CRISPR/Cas9;Rosa26;C2C12

东北林业大学生命科学学院,哈尔滨 150040;黑龙江省医院,哈尔滨 150040

[1]王晓萌;周慧敏;董奕彤;陈胜男;安铁洙;殷萍;王春生-.肌肉特异性表达Cas9示踪同源打靶载体的构建及其在C2C12细胞中的整合)[J].中国实验动物学报,2022(03):333-342

肌肉特异表达,PX459

特异性表达,Cas9,示踪,打靶,C2C12,成肌细胞,细胞分化,小鼠模型,模型制作,人工合成,启动子,CMV,编辑效率,XbaI,T7E1,同源重组,DsRed,红色荧光蛋白,Rosa26,重组载体,共转染,嘌呤霉素,Donor,表达活性,模型制备,基因治疗,CRISPR

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