转录因子E2相关因子2(Nrf2)是细胞重要的调节抗氧化应激的转录因子,其活性状态与病毒感染引起的炎症及免疫清除相关.为研究Nrf2对马传染性贫血病毒(EIAV)复制的影响,本研究通过CRISPR在线设计工具,靶向于Nrf2设计2条特异性sgRNAs,经程序性退火后连接到LentiCRISPRv2-GFP载体中构建重组质粒并分别经测序鉴定正确后,转染HEK293T细胞,24 h后通过western blot筛选沉默Nrf2基因效率最高的sgRNA,结果显示,2条sgRNAs均具有较高的沉默效率.将重组质粒LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1转染HEK293T细胞,利用流式细胞仪筛选表达GFP的单细胞克隆,并扩大培养后,经western blot和测序鉴定,筛选到2株不表达Nrf2的细胞,这2株细胞基因组均缺失一个碱基T,导致Nrf2基因发生移码突变而无法表达.选择其中一株细胞,将该细胞连续传代,选择第10代(G10)、15代(G15)、20代(G20)细胞经western blot鉴定其遗传稳定性,结果显示各代次细胞均未检测到Nrf2基因的表达,表明该敲除细胞系可稳定遗传,将其命名为HEK293T-Nrf2KO细胞.将EIAV感染性克隆CMV3-8及Nrf2基因回补的感染性克隆CMV3-8+pVR1012-flag-Nrf2分别转染HEK293T-Nrf2KO细胞,24 h后收获细胞和上清,通过western blot分别检测细胞和上清中的病毒蛋白Gag及利用反转录酶活性试验(RT)检测上清中病毒的复制.western blot结果显示,与CMV3-8转染的HEK293T细胞相比,转染CMV3-8的HEK293T-Nrf2KO细胞和上清中病毒蛋白Gag表达均上调约1.5倍,而转染CMV3-8+pVR1012-flag-Nrf2HEK293T-Nrf2KO细胞和上清中的病毒蛋白Gag表达下调约50％;RT的检测结果与western blot的检测结果一致.结果表明Nrf2基因可以抑制EIAV在HEK293T细胞中的表达.通过将相关质粒转染HEK293T细胞包装EIAV假病毒,并将其分别感染HEK293T和HEK293T-Nrf2KO细胞24 h后,分别检测病毒的荧光素酶信号,结果显示,与对照组相比,感染假病毒的细胞病毒复制能力显著增强.进一步表明,敲除Nrf2基因有助于病毒对细胞的感染.以上结果表明,Nrf2能够抑制EIAV在HEK293T细胞中的复制.本研究利用CRISPR/Cas9技术构建的敲除Nrf2基因的HEK293T细胞系,可以用于研究宿主Nrf2对EIAV复制的影响,本研究首次证实了宿主Nrf2可以抑制EIAV的复制.本研究构建的HEK293T-Nrf2KO细胞系为宿主Nrf2调控EIAV复制机制的研究提供了有效工具.

Nrf2;CRISPR/Cas9;敲除细胞系;马传染性贫血病毒

马官芹;王岩;林跃智;王晓钧

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/马传染病和慢病毒病研究创新团队,黑龙江 哈尔滨 150069

中国预防兽医学报

[1]马官芹;王岩;林跃智;王晓钧-.宿主细胞转录因子E2相关因子2对EIAV复制影响的初步研究)[J].中国预防兽医学报,2022(02):119-125

EIAV,马传染性贫血病毒,Nrf2KO,8+pVR1012,Gag,Nrf2HEK293T

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