目的 探讨丹参酚酸B(Salvianolic acid B,Sal B)在内皮细胞氧化应激损伤中的保护作用.研究对象 提取原代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),将获取的细胞分成7个实验组:(1)对照组,(2)过氧化氢(hydrogen peroxide,H2O2)组,(3)H2O2+Sal B 组,(4)Sal B组,(5)H2O2+小干扰核糖核酸(small interfering RNA,siRNA)阴性对照(negative control,NC)组,(6)H2O2+高迁移率族蛋白 1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)siRNA 组,(7)H2O2+Sal B+HMGB1 siRNA组.干预措施(1)对照组:予1‰二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)处理;(2)H2O2组:予200 μmol/L H2O2处理;(3)H2O2+Sal B组:10 μmol/L Sal B 预处理 24 h后再予 200 μmol/L H2O2处理;(4)Sal B 组:10 μmol/L Sal B 预处理 24 h 后再予 1‰DMSO 处理;(5)H2O2+siRNA NC 组:siRNA NC 预处理 24h 后再予200 μmol/L H2O2处理;(6)H2O2+HMGB1 siRNA 组:HMGB1 siRNA 预处理24 h 后再予 200 μmol/L H2O2处理;(7)H2O2+Sal B+HMGB1 siRNA 组:10 μmol/L Sal B 及 HMGB1 siRNA 预处理24 h后再予200 μmol/LH2O2处理.观测指标 采用荧光探针法检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,及测量方法 ROS)水平、细胞线粒体膜电位及三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)水平;采用透射电镜观察细胞结构变化及采用Annexin V/PI染色进行流式分析检测细胞膜破损情况;使用蛋白质印迹(Western blot,WB)法检测氧化应激状态下细胞焦亡相关蛋白核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)、消皮素D(gasdermin D,GSDMD)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain,ASC)、胱天蛋白酶-1(caspase-1)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)蛋白;利用siRNA瞬时敲低细胞中HMGB1,观察有无Sal B预处理细胞中焦亡相关分子NLRP3、GSDMD、ASC、caspase-1、IL-1β蛋白表达情况.实验结果使用Graphpad Prism8软件进行统计分析并作图,结果以(x)±s显示,组间对比采用独立样本t检验,P＜0.05为差异有统计学意义.结果 与H2O2组对比,通过细胞计数试剂8(cell counting kit-8,CCK8)检测显示H2O2+10 μmol/L Sal B组增加内皮细胞的存活率（P＜0.000 1）,降低细胞内ROS水平（相对荧光单位P＜0.000 1）,维持细胞内线粒体膜电位及ATP生成（P＜0.01）,膜联蛋白V/碘化丙啶染色流式显示细胞膜破损程度减轻（P＜0.001）,降低细胞内HMGB1信使RNA（messenger RNA,mRNA）表达量（P＜0.01）及HMGB1蛋白浓度（P＜0.01）,同时抑制细胞内焦亡相关分子NLRP3（P＜0.05）、GSDMD（P＜0.05）、ACS（P＜0.05）、caspase-1（P＜0.05）、IL-1β（P＜0.05）表达.使用 siRNA 瞬时敲低细胞内 HMGB1,与 H2O2+Sal B组对比,H2O2+Sal B+HMGB1 siRNA组进一步降低HMGB1表达（P＜0.05）,同时抑制细胞焦亡过程中NLRP3激活(P＜0.05）,进一步减少GSDMD（P＜0.05）、ASC（P＜0.05）、caspase-1（P＜0.05）、IL-1β（P＜0.05）等的释放,表明敲低HMGB1可减轻内皮细胞的焦亡损伤,同时增加Sal B对内皮细胞的保护作用.结论 Sal B通过降低ROS水平抑制HMGB1,维持线粒体内氧化还原稳态,抑制内皮细胞中NLRP3炎性小体形成,改善内皮细胞焦亡.

丹参酚;HMGB1蛋白质;NLR家族;热蛋白结构域包含蛋白3;细胞焦亡

龚明艳;李敏;郭军

暨南大学附属第一医院心血管内科,广州510630

中华心血管病杂志（网络版）

[1]龚明艳;李敏;郭军-.丹参酚酸B通过高迁移率族蛋白1抑制氧化应激诱导的内皮细胞焦亡)[J].中华心血管病杂志（网络版）,2022(12):243-255

H2O2+Sal,B+HMGB1,H2O2+siRNA,H2O2+HMGB1,Prism8

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