典型文献
猪神经介素B受体基因慢病毒过表达载体的构建与鉴定
文献摘要：
[目的]构建猪神经介素B受体(NMBR)基因慢病毒过表达载体,并检测其在猪Leydig细胞中的表达,为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质(Leydig)细胞中的功能提供参考.[方法]根据猪NMBR基因(GenBank登录号:KM058699)CDS序列设计并合成特异性酶切引物,通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列,构建pMD19-T-NMBR 质粒;通过 Xba Ⅰ 和 EcoR Ⅰ 对 pCD513B-1 和 pMD19-T-NMBR 质粒双酶切,构建 pCD513B-1-NMBR重组质粒;将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞(HEK-293T),转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)情况,收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒,并通过倍比稀释法测病毒效价;然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞,转染48 h后观察细胞中GFP表达,收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况.[结果]通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列,大小为1 173 bp;pMD19-T-NMBR重组质粒双酶切为2条特异性条带,条带大小分别与pMD19-T质粒和猪NMBR CDS序列片段大小一致,表明成功构建pMD19-T-NMBR质粒;通过双酶切获得线性化的pCD513B-1和NMBR序列;RT-PCR和测序结果表明,成功构建慢病毒过表达载体pCD513B-1-NMBR;pCD513B-1-NMBR转染48 h后,HEK-293T细胞中呈现大量绿色荧光,表明病毒包装成功,病毒效价约为4×106 TU/mL;NMBR基因慢病毒转染猪Leydig细胞48 h后,80％以上细胞有GFP表达,表明大部分细胞成功转染慢病毒;实时荧光定量PCR检测结果表明,转染慢病毒后能够极显著增加NMBR mRNA的表达(P＜0.01).[结论]本试验成功构建了猪NMBR基因慢病毒过表达载体,并证实猪NMBR基因过表达慢病毒能够增加猪Leydig细胞NMBR基因的表达,为研究NMBR基因过表达在猪Leydig细胞中的作用奠定基础.
文献关键词：
神经介素B受体(NMBR);慢病毒;过表达;Leydig细胞
中图分类号：
作者姓名：
邵淑玉;李佳;马卓;于畅;张莹;张金龙;马志禹
作者机构：
扬州大学兽医学院,扬州225009;江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心,扬州225009;中国农业科学院家禽研究所,扬州225125
文献出处：
引用格式：
[1]邵淑玉;李佳;马卓;于畅;张莹;张金龙;马志禹-.猪神经介素B受体基因慢病毒过表达载体的构建与鉴定)[J].中国畜牧兽医,2022(10):3756-3763
A类：
NMBR,KM058699
B类：
过表达载体,Leydig,基因过表达,睾丸,GenBank,登录号,CDS,序列设计,并合,引物,全长,pMD19,Xba,EcoR,pCD513B,双酶,重组质粒,共转染,人胚,胚肾,肾细胞,HEK,293T,倒置,绿色荧光蛋白,GFP,细胞培养,培养液,上清,稀释法,效价,慢病毒转染,后观,bp,条带,带大,线性化,病毒包装,装成,TU,明大
AB值：
0.183972
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