[目的]探究敲除Toll样受体7(Toll-like receptor 7,TLR7)基因对水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus,VSV)复制的影响.[方法]利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TLR7基因敲除的稳定猪肾上皮细胞(porcine renal epithelial cells,PK15)系.通过构建 pTLR7-sgRNA 重组质粒并转染至 HEK293T/17 细胞,收获慢病毒并感染PK15细胞,经嘌呤霉素筛选后得到PK15-TLR7-/-多克隆细胞,并在Western blotting鉴定后通过有限稀释法获得PK15-TLR7-/-单克隆稳定细胞系.为验证敲除TLR7基因稳定细胞系是否构建成功,分别利用光学显微镜和细胞毒性检测(cell counting kit 8,CCK-8)观察并检测PK15、PK15-TLR7-/-细胞的形态与活力;利用荧光倒置显微镜和流式细胞术观察VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7-/-细胞后病毒增殖情况;利用Western blotting和实时荧光定量PCR分别检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7-/-细胞后GFP蛋白和VSV-N基因mRNA水平的表达情况;利用病毒滴度检测VSV-GFP感染PK15、PK15-TLR7-/-细胞后子代病毒产生情况.[结果]采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建的3种sgRNA均对TLR7进行了有效的编辑,其中sgRNA2的基因编辑效率最高,但敲除TLR7基因并不影响PK15细胞的形态及活力;当感染VSV-GFP后,通过荧光显微镜观察发现,荧光强度随着时间逐次增加,且PK15-TLR7-/-细胞的GFP荧光强度强于PK15细胞.流式细胞术检测结果显示,相同时间点的PK15-TLR7-/-细胞感染VSV-GFP的比例显著或极显著高于PK15细胞(P＜0.05;P＜0.01);实时荧光定量PCR结果表明,感染4～36 h VSV-N基因mRNA相对表达量随着时间逐渐增加,且PK15细胞中VSV-N基因的mRNA相对表达量显著或极显著低于PK15-TLR7-/-细胞(P＜0.05;P＜0.01);Western blotting结果表明,PK15与PK15-TLR7-/细胞中的VSV-GFP GFP蛋白均从6 h开始表达,表达量随时间逐渐增多,且在PK15-TLR7-/-细胞中VSV-GFP GFP蛋白含量比PK15细胞更高;感染VSV-GFP 6 h后子代病毒开始释放,此时PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度低于PK15-TLR7-/-细胞(P＞0.05),但PK15细胞中VSV-GFP子代病毒滴度随着感染时间的增加显著或极显著低于PK15-TLR7--细胞(P＜0.05;P＜0.01).[结论]TLR7基因的敲除可以促进VSV在PK15细胞中的复制,初步验证了 TLR7在天然免疫中的作用,为VSV等RNA病毒性疾病的防控提供新思路.

CRISPR/Cas9;TLR7基因;猪肾上皮细胞(PK15);水疱性口炎病毒(VSV)

孟洁洁;宋月;樊文杰;杨乐;邢嘉友;王江;褚贝贝;杨国宇;王梦迪

河南农业大学,农业农村部动物生化与营养重点开放实验室,郑州450046;河南牧业经济学院,食品与生物工程学院,郑州450046

中国畜牧兽医

[1]孟洁洁;宋月;樊文杰;杨乐;邢嘉友;王江;褚贝贝;杨国宇;王梦迪-.Toll样受体7基因敲除对水疱性口炎病毒增殖的影响)[J].中国畜牧兽医,2022(06):2011-2021

Vesicular,pTLR7,sgRNA2

Toll,样受体,基因敲除,水疱性口炎病毒,病毒增殖,like,receptor,stomatitis,virus,VSV,慢病毒,CRISPR,Cas9,基因编辑技术,技术构建,上皮细胞,porcine,renal,epithelial,cells,PK15,重组质粒,转染,HEK293T,嘌呤霉素,多克,blotting,有限稀释,稀释法,单克隆,稳定细胞系,利用光,光学显微镜,细胞毒性,毒性检测,counting,kit,CCK,倒置,流式细胞术,GFP,病毒滴度,子代病毒,编辑效率,荧光显微镜观察,观察发现,荧光强度,逐次,细胞感染,相对表达量,蛋白含量,天然免疫,病毒性疾病

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