典型文献
增强型猫ω干扰素的筛选及抗病毒活性分析
文献摘要：
为获得增强型猫ω干扰素(FeIFN-ω),本研究通过分子对接方法预测和参考相关位点研究,设计3组定点突变引物.以pJET-FeIFN-ω为模板分别扩增FeIFN-ω基因及其3个突变基因(FeIFN-ω-R35L、FeIFN-ω-A156R、FeIFN-ω-T188R),并连接慢病毒载体pLVX-IRSE,构建重组质粒pLVX-FeIFN-ω、pLVX-FeIFN-ω-R35L、pLVX-FeIFN-ω-A156R、pLVX-FeIFN-ω-T188R.4个重组质粒分别与包装质粒psPAX2和膜蛋白质粒pMD2.G共转染293T细胞包装慢病毒,48 h后收获细胞上清即为慢病毒.分别将4个慢病毒转导293悬浮细胞(293s),扩大培养后收获细胞上清,经镍离子亲和层析柱纯化蛋白,并经SDS-PAGE检测、BCA法测蛋白浓度.结果显示,rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R在293s 细胞中得到高效表达,且蛋白纯化效果好;经BCA法测浓度,4种重组蛋白浓度均约为200 μg/mL,即获得了重组干扰素rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R、rFeIFN-ω-T188R.4种重组干扰素分别经猫肾细胞(CRFK)孵育18 h后接种猫杯状病毒(FCV)或猫疱疹病毒(FHV)12h,经相对荧光定量PCR法检测干扰素抗FCV和FHV活性;4种重组干扰素分别经CRFK细胞孵育12h,经相对荧光定量PCR法检测干扰素刺激基因ISG15、Viperin、IFITM1的转录水平,结果显示:实验组与空白对照组差异极显著(P＜0.01),实验组中rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R与rFeIFN-ω均差异不显著(P＞0.05)或表现为活性降低,rFeIFN-ω-T188R 与 rFeIFN-ω、rFeIFN-ω-R35L、rFeIFN-ω-A156R 差异均显著(P＜0.05)表现为活性增强,并且rFeIFN-ω-T188R抗病毒活性及诱导ISGs的转录水平均比rFeIFN-ω高1倍左右.选择rFeIFN-ω和rFeIFN-ω-T188R分别与His纯化树脂结合,加入等量表达干扰素受体(IFNAR1/R2)的重组质粒转染293T细胞的裂解液,4℃结合过夜,经western blot鉴定干扰素与IFNAR1/R2结合亲和力分析,结果显示,rFeIFN-ω-T188R与IFNAR1的结合能力比rFeIFN-ω高1倍左右,且两者与IFNAR2的结合能力差异不显著.本研究成功筛选到增强型rFeIFN-ω-T188R,为研究高效FeIFN-ω药物奠定了基础.
文献关键词：
猫ω干扰素;真核表达;生物活性
中图分类号：
作者姓名：
李茵;潘玉迪;田进;曲连东
作者机构：
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150069
文献出处：
引用格式：
[1]李茵;潘玉迪;田进;曲连东-.增强型猫ω干扰素的筛选及抗病毒活性分析)[J].中国预防兽医学报,2022(02):195-201,213
A类：
FeIFN,pJET,R35L,A156R,T188R,IRSE,293s,rFeIFN,IFNAR2
B类：
增强型,抗病毒活性,活性分析,分子对接,对接方法,定点突变,引物,突变基因,慢病毒载体,pLVX,重组质粒,psPAX2,膜蛋白质,pMD2,共转染,293T,上清,即为,转导,悬浮细胞,扩大培养,镍离子,亲和层析,层析柱,SDS,PAGE,BCA,蛋白浓度,高效表达,蛋白纯化,重组蛋白,重组干扰素,肾细胞,CRFK,孵育,猫杯状病毒,FCV,猫疱疹病毒,FHV,12h,干扰素刺激基因,ISG15,Viperin,IFITM1,转录水平,空白对照,均差,ISGs,His,等量,IFNAR1,质粒转染,过夜,western,blot,定干,结合亲和力,结合能,能力差异,真核表达
AB值：
0.238124
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