蜱是多种病原体的储存宿主和传播媒介,近年来由蜱体内新发现了多种潜在的人兽共患病病原,因此对蜱所携带病原的早期识别和建立相应的检测与防范措施尤为重要.对辽宁省部分地区采集的长角血蜱样本进行宏转录组测序,发现其中存在一种新的黄病毒科病毒成员,是潜在的人兽共患病病原.为建立针对该病毒快速、灵敏的检测方法,选择其糖蛋白VP1基因进行引物探针设计,通过对反应条件及反应体系的优化,建立了基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR检测方法,标准方程为y=-3.4436x+33.063,相关系数(R2)为0.9999;此方法可检出最低拷贝数为2.5×10copies·μL-1,与普通PCR相比,灵敏度提高约104倍,具有良好的灵敏度;与其他相近病毒的阳性质粒进行反应均无扩增,说明其具有良好的特异性;实验结果的变异系数均低于0.5％,重复性良好;对不同浓度质粒在不同时间进行反应,CT值无显著变化,稳定性良好.采用本方法对2020及2021年采集于辽宁省及内蒙古自治区的18个地区540头蜱进行检测,发现阳性样本数为234头,阳性率为43.3％.结果表明:所建立的实时荧光定量PCR检测方法具有特异性强,灵敏度高,线性关系、重复性及稳定性良好等特点,此检测方法的建立,填补了NALSV在实时荧光定量PCR检测方面的空白,为NALSV的病原检测提供了新的技术方法,对NALSV的分布监测、临床诊断及相关研究奠定了基础,具有一定的现实意义及应用价值.

蜱;实时荧光定量PCR;TaqMan探针;检测

车金;姜峰;陈瑶;毕誉丹;周奕辰;姜凤华;马永春;杨鹏飞;赵永祥;陈泽良;韩小虎

沈阳农业大学重要家畜疫病研究教育部重点实验室,沈阳110161;辽宁省动物疫病预防控制中心,辽宁沈阳110161;丹东市农业农村发展服务中心,辽宁丹东118000;丹东市第六人民医院,辽宁丹东118002

沈阳农业大学学报

[1]车金;姜峰;陈瑶;毕誉丹;周奕辰;姜凤华;马永春;杨鹏飞;赵永祥;陈泽良;韩小虎-.新型黄病毒NALSV检测方法的建立及应用)[J].沈阳农业大学学报,2022(03):366-372

NALSV,4436x+33

建立及应用,病原体,宿主,传播媒介,新发现,人兽共患病,带病,早期识别,建立相应,防范措施,长角血蜱,宏转录组测序,黄病毒科,糖蛋白,VP1,引物,物探,探针设计,反应条件,反应体系,TaqMan,标准方程,低拷贝,拷贝数,10copies,质粒,内蒙古自治区,阳性样本,灵敏度高,病原检测

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