背景 肝癌的发病率和死亡率逐年攀升,对肝癌发生发展机制的研究尤为重要.目的 应用CRISPR/Cas9技术在人肝癌HepG2细胞中敲除组蛋白去乙酰酶6(histone?deacetylase?6,HDAC6)基因,构建HDAC6基因敲除的HepG2稳定表达细胞系,并检测其对人肝癌细胞生长的影响.方法 根据CRISPR/Cas9技术靶点设计原则设计特异性识别HDAC6基因的单向导RNA(single?guide?RNA,sgRNA)序列,构建LentiCRISPR-HDAC6-sgRNA真核重组表达质粒,测序鉴定后包装慢病毒感染HepG2细胞,用嘌呤霉素(puromycin)抗性筛选得到敲除HDAC6基因稳定表达的细胞系,Western?blot鉴定HDAC6基因的敲除效果,CCK-8生长曲线实验检测HDAC6基因敲除对细胞增殖能力的影响,划痕实验和Transwell迁移实验检测HDAC6基因敲除对细胞迁移能力的影响.Western?blot鉴定HDAC6基因敲除对调节α-tubulin乙酰化的影响,细胞存活曲线实验检测HDAC6基因敲除后HepG2对HDAC6抑制剂ACY-1215的敏感度,采用流式细胞术检测HDAC6基因敲除对HepG2细胞周期分布和凋亡的影响.结果 成功构建HDAC6基因敲除的HepG2稳定表达细胞系后,经实验证明HDAC6基因敲除能够显著抑制HepG2细胞的增殖和迁移,使α-tubulin的乙酰化表达增强且能降低HepG2对ACY-1215的敏感度,还能使HepG2细胞发生G1期阻滞,促进HepG2细胞的凋亡.结论 敲除HDAC6基因可以抑制HepG2细胞增殖和迁移,使α-tubulin乙酰化程度增加,调节HepG2细胞对ACY-1215的敏感度,且影响HepG2细胞的周期和凋亡,为进一步研究HDAC6在肝癌中的功能机制奠定了基础.

HDAC6基因;细胞增殖;细胞迁移;乙酰化;ACY-1215;肝癌

张婷;张亚楠;刘婕;叶棋浓;丁丽华;阎新龙

北京工业大学 环境与生命学部,北京 100124;军事科学院 军事医学研究院 生物工程研究所,北京100850

解放军医学院学报

[1]张婷;张亚楠;刘婕;叶棋浓;丁丽华;阎新龙-.HDAC6基因敲除的人肝癌细胞系的构建及其生物学功能鉴定)[J].解放军医学院学报,2022(05):595-601

LentiCRISPR

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