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宿主蛋白核仁素与病毒基因组相互作用对牛肠道病毒复制影响的研究
文献摘要：
为了探究宿主蛋白核仁素(NCL)对牛肠道病毒(BEV)复制的影响及其作用机制,本研究将构建的重组质粒pHA-NCL和NCL shRNA分别转染BHK-21细胞,采用western blot检测细胞中NCL的表达.结果显示,NCL在BHK-21细胞中分别获得了过表达和下调表达.在此基础上,将BEV以MOI 1感染上述过表达和下调NCL表达的BHK-21细胞,于感染8h、10 h和12 h时收集上清液和细胞,采用qPCR、western blot(检细胞)分别检测病毒基因组RNA的复制水平、BEV结构蛋白VP1表达水平及通过上清液检测病毒滴度的变化.结果表明,过表达NCL明显促进BEV在BHK-21细胞中的复制,而下调NCL的表达则明显抑制BEV的复制.利用兔源NCL特异性抗体及同源IgG对感染BEV的BHK-21细胞进行RNA免疫共沉淀试验,并利用RT-PCR检测免疫复合物中BEV相应基因片段.结果显示,免疫复合物NCL抗体-NCL蛋白-病毒RNA免疫复合物中扩增出BEV目的基因片段,而IgG抗体对照组未扩增出任何条带,表明NCL与BEV基因组RNA存在相互作用.通过激光共聚焦试验观察BEV感染BHK-21细胞后不同时间(5 h和10 h)NCL蛋白的亚细胞定位,结果显示,BEV感染细胞后使NCL由核仁迁移至细胞质,并与病毒基因组在细胞质中共定位.利用同源重组试剂盒将线性化的pmirGLO及扩增的BEV内部核糖体进入位点(IRES)构建双荧光素酶报告质粒pmirGLO-BEV IRES,并经测序鉴定正确后分别转染NCL过表达和下调表达的BHK-21细胞,采用双荧光素酶试剂盒分别检测上述细胞中两种荧光素酶FLuc和RLuc(BEV IRES依赖性的)的活性.结果显示,与转染pHA的对照细胞相比,NCL过表达的BHK-21细胞中FLuc值无显著变化,而RLuc值显著升高(P＜0.01);与转染shRNA NC的对照细胞相比,NCL表达下调的BHK-21细胞中,FLuc值无显著变化,而RLuc值显著降低(P＜0.01).表明,NCL正调控BEV IRES的翻译起始活性.本研究首次证实NCL与BEV基因组间存在相互作用,该互作可促进BEV IRES介导的病毒蛋白翻译活性,从而提高BEV的复制水平,为BEV复制的分子调控机制提供了新的见解.
文献关键词：
牛肠道病毒;核仁素;内部核糖体进入位点;病毒复制
中图分类号：
作者姓名：
魏丹丹;孙超;常继涛;于力
作者机构：
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/牛羊传染病创新团队,黑龙江 哈尔滨 1550069
文献出处：
引用格式：
[1]魏丹丹;孙超;常继涛;于力-.宿主蛋白核仁素与病毒基因组相互作用对牛肠道病毒复制影响的研究)[J].中国预防兽医学报,2022(06):598-605
A类：
核仁素,pHA,RLuc
B类：
宿主蛋白,病毒基因组,牛肠道病毒,病毒复制,NCL,BEV,重组质粒,shRNA,转染,BHK,western,blot,过表达,MOI,染上,8h,上清液,qPCR,复制水平,结构蛋白,VP1,病毒滴度,兔源,特异性抗体,IgG,免疫共沉淀,免疫复合物,目的基因,出任,条带,共聚,试验观察,亚细胞定位,移至,细胞质,共定位,同源重组,试剂盒,线性化,pmirGLO,内部核糖体进入位点,IRES,双荧光素酶,FLuc,正调控,病毒蛋白,蛋白翻译,分子调控机制
AB值：
0.195722
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