目的:为进行基于CRISPR-Cas9的全基因组高通量易位测序,利用慢病毒转导构建表达Cas9蛋白的Nalm6-Cas9单克隆细胞系.方法:使用慢病毒载体lentiCas9-Blast、psPAX2和pMD2.G共转染HEK293T细胞包装病毒,病毒感染Nalm6细胞后使用杀稻瘟菌素(Blasticidin)筛选,通过有限稀释法获得多个表达Cas9蛋白的单克隆细胞株.Western blot检测单克隆细胞株中Cas9蛋白的表达水平,细胞计数检测单克隆细胞株的细胞增殖活性.构建 lentiCRISPRv2GFP-Δcas9、lentiCRISPRv2GFP-Δcas9-AF4、lentiCRISPRv2GFP-Δcas9-MLL 质粒,并分别与pSPAX2、pMD2.G质粒共转染包装病毒,收集病毒感染Nalm6-Cas9单克隆细胞株,使用T载体克隆检测单克隆细胞株的Cas9蛋白的功能.结果:Western blot结果显示,Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株高水平表达Cas9蛋白;细胞计数分析结果显示,Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株细胞增殖活性与对照细胞比较无显著差异;T载体克隆检测显示,Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株Cas9蛋白具有高水平切割活性,对AF4和MLL基因的编辑效率在90％以上.结论:本研究得到了稳定表达高活性Cas9蛋白的Nalm6-Cas9_1-6单克隆细胞株,为基于CRISPR/Cas9全基因组高通量易位测序技术探究治疗相关性白血病中MLL易位连接机制提供依据.

Nalm6细胞系;Cas9蛋白;慢病毒;治疗相关性白血病;全基因组高通量易位测序

李倾城;黄俊彬;薛红漫;杨默;朱瀓明;李志光;董俊超;陈纯

中山大学附属第七医院(深圳)儿科,儿童血液肿瘤专科,广东深圳518107;中山大学附属第七医院(深圳)科研中心,广东深圳518107;香港中文大学儿科血液学/肿瘤学/BMT系,香港999077;中山大学中山医学院,广东广州510080

中国实验血液学杂志

[1]李倾城;黄俊彬;薛红漫;杨默;朱瀓明;李志光;董俊超;陈纯-.用于全基因组易位测序的Nalm6-Cas9细胞系的构建)[J].中国实验血液学杂志,2022(05):1384-1390

全基因组高通量易位测序,lentiCas9,Blasticidin,lentiCRISPRv2GFP,pSPAX2,治疗相关性白血病

Nalm6,转导,建表,单克隆细胞系,慢病毒载体,psPAX2,pMD2,共转染,HEK293T,装病,稻瘟菌,菌素,有限稀释,稀释法,细胞株,blot,细胞增殖活性,cas9,AF4,MLL,质粒,克隆检测,株高,切割活性,编辑效率,稳定表达,高活性,技术探究,连接机制

0.177188