目的:构建MyD88基因缺失的RAW264.7细胞株,为探寻MyD88基因的作用提供重要载体.方法:制备HBLV-Cas9-PURO慢病毒,感染RAW264.7细胞,得到RAW264.7-Cas9细胞株.依据CRISPR/Cas9系统原理,设计3条靶向MyD88基因的sgRNA,慢病毒包装后感染RAW264.7-Cas9细胞株,观察感染效果,PCR和Western blot验证MyD88基因敲除水平并筛选稳转细胞株.选取敲除效果最佳株,经LPS和PGN诱导后,荧光定量PCR和ELISA检测TNF-α表达和分泌.结果:HBLV-Cas9-PURO感染后RAW264.7细胞Cas9基因扩增明显升高,RAW264.7-Cas9细胞株构建成功.包装目的基因的慢病毒感染RAW264.7-Cas9后,荧光显微镜观察导入成功;PCR显示与对照组相比,HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后MyD88基因表达显著下调;Western blot进一步证实,HBLV-m-MyD88 gRNA1-GFP和HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP感染后MyD88蛋白表达下降,且HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP组下降最为显著.LPS和PGN诱导HBLV-m-MyD88 gRNA3-GFP组细胞后,TNF-α表达和分泌水平均下调.结论:利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术成功构建稳定敲除MyD88基因的RAW264.7细胞株.

慢病毒;CRISPR/Cas9;MyD88;RAW264.7细胞

王燕;陈为;董明鑫;孙成彪;张剑旭;常影;刘文森;许娜

中国农业科学院长春兽医研究所,长春130122;吉林医药学院,吉林132013

中国免疫学杂志

[1]王燕;陈为;董明鑫;孙成彪;张剑旭;常影;刘文森;许娜-.RAW264.7细胞MyD88基因缺失株构建)[J].中国免疫学杂志,2022(14):1739-1743

gRNA3,gRNA1

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