目的 利用CRISPR/Cas9敲除文库在人正常肺上皮细胞致瘤性转化过程中进行全基因组筛选,以发现新的人肺癌抑癌基因,并利用临床非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)样本数据库进行初步验证.方法 构建稳定表达Cas9蛋白的人正常肺上皮BEAS-2B细胞系,在该细胞中感染含有77 441个单链向导RNA(sgRNA)、靶向19 114个人类基因的Brunello慢病毒文库,于裸鼠皮下移植.提取全瘤体细胞(Tumor)及移植前细胞(Input)的全基因组DNA,扩增sgRNA序列,建库进行深度测序.通过分析Tumor中sgRNA读数占比及Tumor与Input中sgRNA读数差异倍数的改变,筛选功能缺失后诱导BEAS-2B细胞致瘤性转化的抑癌基因,并利用公共数据平台进行初步验证.结果 成功在稳定表达Cas9蛋白的BEAS-2B细胞中进行了文库感染及裸鼠皮下成瘤实验.只有感染文库的细胞在部分接种位点成瘤.测序结果显示Tumor中只检测到少数sgRNA,选取sgRNA的读数占总读数的比例＞1％或有2个及以上sgRNA被显著富集的38个基因为有效的人肺癌候选抑癌基因,包括NF2、PTEN等已知抑癌基因及未在肺癌中报道过的候选抑癌基因,如AP2M1、PSENEN等.富集分析发现候选抑癌基因在Notch和Hippo信号等参与癌症发生的关键生物学通路中富集.应用临床NSCLC样本数据库证实38个候选抑癌基因在NSCLC样本中均发生了突变,其中突变率＞2％的17个基因中有14个与KRAS或TP53发生共突变,3个突变与预后相关;30个基因在NSCLC样本中的表达水平与正常癌旁组织有明显差异,17个基因的表达水平与患者的预后密切相关.结论 利用体内全基因组CRISPR/Cas9技术筛选出38个人肺癌候选抑癌基因,并在临床NSCLC样本数据库中得到了初步验证.

致瘤性转化;CRISPR/Cas9;抑癌基因;全基因组筛选;肺癌

赵斌瑜;张俊磊;王加琪;阮艳;张月;刘恋恋;蹇锐;熊加祥;姚忠祥

400038重庆,陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院生理学教研室;400038重庆,陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院组织学与胚胎学教研室;400038重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院眼科;400038重庆,陆军军医大学(第三军医大学)基础医学院教学实验中心

陆军军医大学学报

[1]赵斌瑜;张俊磊;王加琪;阮艳;张月;刘恋恋;蹇锐;熊加祥;姚忠祥-.正常肺上皮细胞致瘤性转化中抑癌基因的全基因组筛选及数据库验证)[J].陆军军医大学学报,2022(06):503-512

致瘤性转化,Brunello,AP2M1,PSENEN

肺上皮细胞,抑癌基因,全基因组筛选,CRISPR,Cas9,敲除,文库,转化过程,非小细胞肺癌,small,cell,lung,cancer,NSCLC,样本数据库,稳定表达,BEAS,2B,细胞系,单链,向导,sgRNA,人类基因,慢病毒,下移,瘤体,体细胞,Tumor,移植前,Input,建库,深度测序,读数,数占,倍数,公共数据平台,裸鼠皮下成瘤,有感,分接,或有,NF2,PTEN,未在,中报,富集分析,Notch,Hippo,生物学通路,中富,突变率,KRAS,TP53,共突变,癌旁组织,技术筛选

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