典型文献
CRISPR-Cas9基因编辑报道系统应用于AAVS1安全港的定点整合
文献摘要:
目的 利用ZFN与TALEN基因编辑以及同源重组技术将Cas9表达框、基因编辑效率荧光报道系统以及真核细胞筛选标记的DNA超长片段定点插入HEK-293T细胞基因组AAVS1安全港,建立可用于衡量CRISPR-Cas9基因编辑的稳定细胞株.方法 利用分子克隆技术构建AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒.利用脂质体将识别并切割AAVS1基因组序列的ZFN和TALEN质粒以及AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒共转染入HEK-293T细胞.使用嘌呤霉素筛选获得单克隆细胞后,利用杀稻瘟菌素S筛选、红色荧光检测、Cas9 Western blot以及基因组PCR鉴定等方法获得CRISPR-Cas9基因编辑报道系统完整整合入AAVS1安全港的稳定细胞株.继而,将EGFP修复模板单链DNA及EGFP sgRNA瞬时转染入这些稳定细胞株,对失去荧光的EGFP进行基因编辑,恢复其发光功能,并通过荧光检测技术验证基因编辑结果.结果 成功获得3株同时具有嘌呤霉素和杀稻瘟菌素S抗性以及表达红色荧光蛋白的单克隆细胞,Western blot证实其成功表达Cas9蛋白,基因组PCR鉴定目的基因成功整合入基因组AAVS1位点.经EGFP基因编辑后,细胞恢复绿色荧光.结论 利用ZFN与TALEN将完整的CRISPR-Cas9基因编辑报道系统成功整合入HEK-293T细胞基因组的AAVS1安全港,整合DNA片段长度达11.5 kb,并利用Cas9成功编辑EGFP报道基因.
文献关键词:
AAVS1;CRISPR;ZFN;TALEN;基因编辑
中图分类号:
作者姓名:
曹淳;陈耀;何佳佳;张毛雪;钱正韬;周小明
作者机构:
江苏大学医学院基础医学与医学技术学院,镇江 212013
文献出处:
引用格式:
[1]曹淳;陈耀;何佳佳;张毛雪;钱正韬;周小明-.CRISPR-Cas9基因编辑报道系统应用于AAVS1安全港的定点整合)[J].华中科技大学学报(医学版),2022(06):825-829
A类:
AAVS1
B类:
CRISPR,Cas9,基因编辑,系统应用,安全港,定点整合,ZFN,TALEN,同源重组,重组技术,编辑效率,真核细胞,筛选标记,超长,长片,HEK,293T,稳定细胞株,分子克隆,克隆技术,技术构建,all,one,质粒,脂质体,基因组序列,共转染,嘌呤霉素,单克隆细胞,稻瘟菌,菌素,荧光检测,blot,整整,EGFP,修复模板,单链,sgRNA,技术验证,红色荧光蛋白,目的基因,复绿,段长度,kb,报道基因
AB值:
0.277791
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