[背景]成簇规律间隔的短回文重复序列相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associatedprotein,CRISPR/Cas9)已被广泛证实是高效、强大的第三代基因编辑工具,在发现功能基因等领域取得了重要进展,但至今尚无利用该方法挖掘猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)宿主基因的报道.[目的]利用CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选PEDV复制相关基因,并进行候选基因的初步验证,为培育抗PEDV种猪提供科学参考.[方法]通过CRISPR/Cas9技术构建人肝癌细胞系(Huh-7)全基因组敲除文库,利用PEDV感染Huh-7文库细胞,随后经过高通量测序筛选影响PEDV复制的关键宿主因子,结合基因干扰和检测病毒效价等相关试验对影响PEDV复制的候选基因进行初步验证.[结果]构建了CRISPR/Cas9系统在全基因组范围内筛选PEDV复制相关基因的方法,将富集程度排名靠前的整合素 α11(integrinα11,ITGA11)、哺乳动物复制蛋白 A2(replicationproteinA2,RPA2)、驱动蛋白家族成员2A(kinesin family member 2A,KIF2A)、诱导髓系白血病细胞分化蛋白1(induced myeloid leukemia cell differentiation protein 1,MCL1)、多聚 ADP 核糖化酶 1[poly(ADP-ribose)polymerase 1,PARP1]和囊泡单胺转运蛋白(vesicular monoamine transporter,SLC18A1)基因进行了验证;采用siRNA对上述基因分别进行干扰后,结果与对照组相比,干扰ITGA11可显著降低PEDV猪源靶向细胞IPEC-J2中PEDV-NmRNA、蛋白表达水平及子代病毒滴度.[结论]基于CRISPR/Cas9系统的全基因组敲除文库可作为挖掘PEDV复制相关功能基因的有效工具,ITGA11基因可作为一种制备抗PEDV猪种潜在的靶基因.

成簇规律间隔的短回文重复序列相关蛋白(CRISPR/Cas9);猪流行性腹泻病毒;遗传筛选;整合素α11

张雪;范宝超;赵永祥;钱嘉莉;王传红;徐红;郭容利;李彬;贾斌

石河子大学动物科技学院,新疆石河子832000;江苏省农业科学院兽医研究所,江苏南京210014

微生物学通报

[1]张雪;范宝超;赵永祥;钱嘉莉;王传红;徐红;郭容利;李彬;贾斌-.基于CRISPR/Cas9系统筛选猪流行性腹泻病毒复制相关基因及其验证)[J].微生物学通报,2022(12):5138-5149

associatedprotein,ITGA11,replicationproteinA2,囊泡单胺转运蛋白,SLC18A1,NmRNA

CRISPR,Cas9,猪流行性腹泻病毒,病毒复制,回文,重复序列,序列相关,clustered,regularly,interspaced,short,palindromic,repeats,实是,第三代,基因编辑工具,功能基因,重要进展,无利,porcine,epidemic,diarrhea,virus,PEDV,宿主基因,全基因组,候选基因,种猪,技术构建,人肝癌细胞,细胞系,Huh,敲除,文库,宿主因子,基因干扰,效价,整合素,integrin,哺乳动物,RPA2,驱动蛋白,白家,kinesin,family,member,KIF2A,髓系白血病,细胞分化,induced,myeloid,leukemia,cell,differentiation,MCL1,多聚,ADP,核糖,糖化酶,ribose,polymerase,PARP1,vesicular,monoamine,transporter,siRNA,猪源,IPEC,J2,蛋白表达水平,子代病毒,病毒滴度,相关功能,靶基因,遗传筛选

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