基因克隆是解析基因功能的重要手段,但仍有很多基因难以克隆,比如高AT含量(>60％)基因组来源的DNA.ExoCET克隆技术通过联合核酸外切酶介导的体外同源重组和大肠杆菌RecET重组酶介导的细胞内同源重组,不仅能从微生物基因组中靶向抓取>100 kb的大片段,而且能高效组装>13个DNA片段,是基因克隆的有力工具,迄今未有利用ExoCET技术从AT含量>63％的基因组克隆大片段的报道.本研究以AT含量为69％的海洋单细胞光合蓝细菌原绿球藻MIT 9301菌株的基因组为研究对象,探究了利用ExoCET技术进行高AT含量基因组大片段克隆的最佳条件.结果显示:①在核酸外切酶介导的体外同源重组时使用Gibson体系较T4聚合酶体系能获得更高的克隆效率;②载体应选择单拷贝的细菌人工染色体(BAC),多拷贝质粒载体会导致克隆失败;③ExoCET可以从原绿球藻基因组上抓取>80 kb的大片段,并且能以100％的正确率组装11个3 kb的DNA片段;④可以一步同时抓取4个7～20 kb的基因组大片段.大规模基因组测序显示高AT含量生物占比超过30％,该研究建立的ExoCET-BAC策略将为高AT含量生物的基因组功能研究提供高效使能技术.

难克隆DNA;高AT含量;基因组;同源重组;直接克隆;DNA组装;ExoCET

姜婵娟;崔天琦;孙洪娈;焦念志;符军;张友明;王海龙

山东大学微生物技术研究院,微生物技术国家重点实验室,山东 青岛 266237;山东大学海洋研究院,山东 青岛266237

合成生物学

[1]姜婵娟;崔天琦;孙洪娈;焦念志;符军;张友明;王海龙-.ExoCET-BAC策略高效抓取和组装高AT含量基因组大片段)[J].合成生物学,2022(01):238-251

ExoCET,RecET,光合蓝细菌,原绿球藻,直接克隆

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