目的:探讨低氧诱导的长链非编码核内小RNA宿主基因14(long non?coding small nucleolar RNA host gene 14,lncRNA SNHG14)在胶质瘤替莫唑胺(temozolomide,TMZ)耐药中的作用和潜在机制.方法:根据不同处理将实验分为常氧组、低氧组、对照组(NC组)和TMZ组,利用real-time PCR和蛋白质印迹法分别检测胶质瘤细胞SNB19和U251中lncRNA SNHG14和O6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(O6-methylguanine DNA methyltransferase,MGMT)的表达水平,分析lncRNA SNHG14表达水平与低氧和TMZ处理的关系.利用siRNA干扰胶质瘤细胞中lncRNA SNHG14表达,将转染后的胶质瘤细胞分为si-对照组(si-NC组)和si-SNHG14组,利用real-time PCR检测干扰效率,并采用蛋白质印迹法检测TMZ敏感性调控关键因子MGMT的表达变化,采用流式细胞术检测细胞凋亡;此外,增设常氧组和低氧组,应用MTT法检测不同TMZ浓度梯度下各组胶质瘤的细胞活性,分析lncRNA SNHG14对胶质瘤TMZ敏感性的影响.利用在线工具针对性地预测与lncRNA SNHG14和MGMT结合的miRNAs.应用real-time PCR观察不同环境下si-NC组、si-SNHG14组、常氧组和低氧组miR-143的丰度变化.利用miR-143拟似剂(mimics)和抑制剂(inhibitor)改变胶质瘤细胞中miR-143水平,将实验设置为NC inhibitor组、miR-143 inhibitor组、NC mimics组和miR-143 mimics组,采用real-time PCR检测干扰效率,应用蛋白质印迹法检测MGMT的表达水平,分析miR-143对MGMT水平的影响.对NC inhibitor组、miR-143 inhibitor组、NC mimics组和miR-143 mimics组进行不同干预,采用双荧光素酶报告实验观察lncRNA SNHG14和MGMT荧光素酶的活性变化,验证lncRNA SNHG14、miR-143和MGMT之间的靶向调控关系.最后,设置NC组和lncRNA SNHG14过表达组,通过RNA结合蛋白免疫沉淀实验检测各组中miR-143和MGMT的丰度变化,分析lncRNA SNHG14、miR-143和MGMT间的竞争结合关系.结果:与常氧组相比,低氧组可以促进胶质瘤细胞中lncRNA SNHG14表达;与NC组相比,TMZ组能显著抑制lncRNA SNHG14的表达(均P<0.05).与si-NC组相比,si-SNHG14组可有效抑制lncRNA SNHG14表达,且MGMT表达水平呈现显著下降,细胞凋亡率显著升高(均P<0.05).随着TMZ浓度的升高,si-SNHG14组胶质瘤细胞活力显著低于si-NC组,低氧组的细胞活力显著高于常氧组(均P<0.05).在线工具预测发现:miR-143与lncRNA SNHG14和MGMT存在结合位点,低氧组miR-143丰度显著低于常氧组,si-SNHG14组miR-143丰度显著高于si-NC组(均P<0.05).miR-143 mimics组或miR-143 inhibitor组可显著过表达或低表达miR-143(均P<0.05),但NC mimics组或NC inhibitor组与NC组相比,差异均无统计学意义(均P>0.05);miR-143 inhibitor组MGMT蛋白水平显著上调(P<0.01),miR-143 mimics组则反之(P<0.01).双荧光素酶报告实验显示:NC mimics组或NC inhibitor组与各自的对照组相比,差异均无统计学意义(均P>0.05);miR-143 mimics组野生型SNHG14和MGMT的荧光素酶活性显著下调,而miR-143 inhibitor组野生型SNHG14和MGMT的荧光素酶活性显著上调(分别P<0.01和P<0.05);但突变型SNHG14和MGMT的荧光素酶活性均无明显变化(均P>0.05).RNA结合蛋白免疫沉淀实验结果显示:与NC组相比,过表达lncRNA SNHG14组细胞中沉淀的argonaute 2蛋白上结合有更多的lncRNA SNHG14,但MGMT mRNA丰度却出现显著下降,差异均有统计学意义(均P<0.01),lncRNA SNHG14、miR-143和MGMT之间存在靶向调控关系.结论:低氧下胶质瘤细胞中表达上调的lncRNA SNHG14靶向miR-143,解除miR-143对MGMT的抑制,从而促进胶质瘤细胞产生TMZ耐药.

胶质瘤;低氧;替莫唑胺;耐药;长链非编码RNA

赵海婷;孟莉;廖新斌;刘燚;莫鑫;龚梦麒;廖艺玮

中南大学湘雅医院神经内科,长沙410008;中南大学湘雅医院放射科,长沙410008;中南大学湘雅医院神经外科,长沙410008

中南大学学报（医学版）

[1]赵海婷;孟莉;廖新斌;刘燚;莫鑫;龚梦麒;廖艺玮-.低氧诱导长链非编码核内小RNA宿主基因14促进胶质瘤替莫唑胺耐药的机制)[J].中南大学学报（医学版）,2022(07):829-838

argonaute

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