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稳定敲降多腺苷二磷酸核糖聚合酶1的HaCaT细胞的建立
文献摘要：
目的 构建多腺苷二磷酸核糖聚合酶1(PARP-1)短发夹RNA(shRNA)的慢病毒载体质粒,获取稳定敲降PARP-1蛋白的人永生化表皮角化形成细胞HaCaT(PARP-1 KD HaCaT细胞).方法 针对PARP-1 mRNA设计干扰序列shRNA,用限制性内切酶技术将干扰序列shRNA插入慢病毒载体质粒pLVX-shRNA2-puro,构建含PARP-1 shRNA的慢病毒载体质粒(pLVX-shRNA2-puro-PARP-1),酶切和核酸测序鉴定该质粒是否构建成功.采用脂质体转染法将该质粒载体转染至HEK293T细胞包装慢病毒.将带有PARP-1 shRNA的慢病毒颗粒〔感染复数为100〕感染HaCaT细胞,经嘌呤霉素3 mg·L-1筛选15 d,用Western印迹法和实时定量PCR(RT-qPCR)检测PARP-1蛋白和mRNA表达水平,验证PARP-1 KD HaCaT细胞PAPR-1敲降效果.用相同方式构建阴性对照细胞(NC HaCaT细胞).随后分别将NC HaCaT和PARP-1 KD HaCaT细胞分为细胞对照组、DNA损伤剂硫芥(SM)100和1000μmol·L-1组,孵育6和24 h后制备细胞裂解液,用Luminex法测定磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)表达水平.结果 DNA测序和酶切结果表明,所构建的慢病毒载体质粒中含有PARP-1 shRNA序列,表明含PARP-1 shRNA的慢病毒载体质粒构建成功.RT-qPCR结果显示,PARP-1 KD HaCaT细胞中PARP-1 mRNA水平降低为NC HaCaT细胞的约14％;Western印迹法结果显示,PARP-1 KD HaCaT细胞中PARP-1蛋白表达水平降低为NC HaCaT细胞的约10％.DNA损伤剂SM 1000μmol·L-1作用24 h后,与NC HaCaT细胞相比,PARP-1 KD HaCaT细胞γ-H2AX表达水平明显增加(P<0.01).结论 成功构建含PARP-1 shRNA的慢病毒载体质粒,并获得稳定敲降PARP-1的HaCaT细胞.
文献关键词：
多腺苷二磷酸核糖聚合酶1;RNA干扰;HaCaT细胞
中图分类号：
作者姓名：
刘峰;肖智勇;程军平;蒋宁;周文霞;张永祥
作者机构：
军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所,抗毒药物与毒理学国家重点实验室,北京 100850
文献出处：
引用格式：
[1]刘峰;肖智勇;程军平;蒋宁;周文霞;张永祥-.稳定敲降多腺苷二磷酸核糖聚合酶1的HaCaT细胞的建立)[J].中国药理学与毒理学杂志,2022(08):584-591
A类：
B类：
多腺苷二磷酸核糖聚合酶,HaCaT,PARP,短发,发夹,慢病毒载体,永生化,角化,KD,限制性内切酶,酶技术,pLVX,shRNA2,puro,脂质体转染,HEK293T,慢病毒颗粒,复数,嘌呤霉素,实时定量,qPCR,PAPR,NC,SM,孵育,Luminex,磷酸化,组蛋白,H2AX,切结,质粒构建,平降,蛋白表达水平
AB值：
0.197079
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