[目的]探究miR-181a和miR-181d-5p在荣昌猪原代前体脂肪细胞分化中的作用及机制.[方法]通过比对种子序列差异分析miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠不同物种间的序列保守性;实时荧光定量PCR检测miR-181a和miR-181d-5p在猪肌肉和背部皮下脂肪组织中表达;利用miRandn和TargetScan在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p的靶基因,并进行GO和KEGG富集分析;使用RNAhybrid在线软件预测miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合自由能.取7日龄雄性荣昌猪背部皮下脂肪组织分离原代前体脂肪细胞.分别设计miR-181a和miR-181d-5p的靶基因野生型和突变型载体,并与对应的miRNA共转染前体脂肪细胞,进行双荧光素酶报告基因试验验证miRNA与靶基因的靶标关系,测定miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的结合情况.构建 miR-181a 和 miR-181d-5p 的模拟物(miR-181amimics、miR-181d-5p mimics)、抑制物(miR-181a inhibitor、miR-181d-5p inhibitor)、阴性对照(NC)及其靶基因的干扰siRNA(Gene-siRNA),转染细胞6 h后进行诱导分化.6 d后,分别对不同处理的细胞通过实时荧光定量PCR检测基因表达情况,油红O染色鉴定甘油三酯生成情况.[结果]保守性分析结果表明,miR-181a和miR-181d-5p在猪、人、大鼠和小鼠间具有高度序列保守性;miR-181a与miR-181d-5p在猪不同组织中定量结果显示,miR-181a与miR-181d-5p在猪脂肪组织中特异性高表达;靶基因预测结果表明,miR-181a与miR-181d-5p的靶基因分别为线粒体甘油3-磷酸脱氢酶(GPD2)和环腺苷酸反应元件(CREB1);GO和KEGG功能富集分析发现,miR-181a和miR-181d-5p的靶基因可以抑制甘油三酯生成,调节脂肪细胞分化,且miR-181a和miR-181d-5p与其靶基因的自由结合能均＜-87.8 kJ/mol;双荧光素酶报告基因试验结果表明,转染miR-181a与miR-181d-5p的mimics可以极显著抑制靶基因3'-UTR野生型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性(P＜0.01),但不影响靶基因突变型双荧光素酶报告载体中的荧光素酶活性.诱导分化结果表明,与未分化脂肪细胞(0 d)相比,miR-181a表达量在分化的第4天显著升高(P＜0.05),到第6天达到极显著差异(P＜0.01);miR-181d-5p及GPD2和CREB1基因表达量在分化的第4、6天均极显著升高(P＜0.01).miR-181a和miR-181d-5p的细胞转染试验均得到相似结果,与NC组相比,mimics组miR-181a与miR-181d-5p的表达量均极显著上升(P＜0.01),inhibitor 组 miR-181a 与 miR-181d-5p 表达量均极显著下降(P＜0.01);mimics 和 siRNA组的GPD2与CREB1基因表达量均极显著下降(P＜0.01),inhibitor组GPD2与CREB1基因表达量均极显著上升(P＜0.01);mimics和siRNA组PPARγ和C/EBPα基因的相对表达量均显著或极显著上升(P＜0.05;P＜0.01),inhibitor组PPARγ和C/EBPα基因的表达量均显著下降(P＜0.05);油红O染色结果表明,与NC组相比,mimics和siRNA组细胞脂滴数目增加,inhibitor组细胞脂滴数目减少.[结论]miR-181a和miR-181d-5p可以分别靶向结合GPD2和CREB1基因3'-UTR区域序列,降低GPD2和CREB1基因的表达,促进猪前体脂肪细胞成脂分化.

荣昌猪;miR-181a;miR-181d-5p;脂肪细胞

四川农业大学动物科技学院,成都611130;四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室,成都610066

[1]王梽名;王宇豪;顾以韧;龙科任;李明洲;金龙-.miR-181a和miR-181d-5p对猪前体脂肪细胞成脂分化调控的研究)[J].中国畜牧兽医,2022(06):2195-2207

miRandn,181amimics,GPD2

181d,5p,猪前体脂肪细胞,成脂分化,分化调控,荣昌猪,原代,脂肪细胞分化,子序列,序列差异,种间,保守性,猪肌肉,背部,皮下脂肪组织,组织中表达,TargetScan,软件预测,RNAhybrid,结合自由能,日龄,组织分离,野生型,突变型,miRNA,共转染,双荧光素酶报告基因,靶标,抑制物,inhibitor,NC,siRNA,Gene,诱导分化,不同处理,甘油三酯,度序列,不同组织,猪脂肪,靶基因预测,环腺苷酸,反应元件,CREB1,功能富集分析,结合能,kJ,UTR,双荧光素酶报告载体,荧光素酶活性,基因突变,未分,天显,基因表达量,细胞转染,PPAR,EBP,相对表达量,染色结果,脂滴

0.157885