目的 探究肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)通过调控内质网钙稳态蛋白(CHERP)影响软骨细胞自噬功能的相关机制.方法 衣霉素(TM)处理人软骨细胞C28/I2,Western blot检测不同时间点的内质网应激和自噬相关蛋白指标.4μ8c、雷帕霉素(Rapa)处理C28/I2(分为:NC组、4μ8c组、Rapa组、4μ8c+Rapa组),Western blot检测自噬相关蛋白指标.分别从软骨组织特异性ERN1基因敲除小鼠(ERN1 CKO)和对照小鼠(Control)软骨组织分离原代软骨细胞,qPCR检测ERN1及自噬相关蛋白ATG5、ATG7的mRNA水平,Western blot检测IRE1α/p-IRE1α、CHERP表达水平,流式细胞术检测胞内钙离子含量.巴佛洛霉素A1(Bafilomycin A1)处理原代软骨细胞(分为Control组、Control+Bafilomycin A1组、ERN1 CKO组、ERN1 CKO+Bafilomycin A1组),Western blot检测LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的表达.自噬双荧光病毒在Rapa处理下检测自噬流(分为Control+Rapa组、ERN1 CKO+Rapa组).C28/I2中过表达CHERP与IRE1α,免疫荧光检测自噬水平.结果 TM处理C28/I2细胞后,内质网应激相关标志蛋白表达上调,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调(P<0.05),p62表达下调(P<0.05).相较对照组,Rapa上调LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值(P<0.001),4μ8c+Rapa组相较Rapa组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低(P<0.05).相较于对照组,原代软骨细胞中敲除ERN1/IRE1α后,ERN1(P<0.01)、ATG5(P<0.001)、ATG7(P<0.001)mRNA水平显著下调.IRE1α/p-IRE1α蛋白表达缺失或显著下调(P<0.01),CHERP蛋白表达上调(P<0.05),胞内钙离子含量显著上升(P<0.001).巴佛洛霉素A1处理原代软骨细胞后,Control+Bafilomycin A1组较Control组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调(P<0.01),ERN1 CKO+Bafilomycin A1组较ERN1 CKO组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上调(P<0.05)、较Control+Bafilomycin A1组的LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值下降(P<0.05).自噬双荧光病毒处理后,ERN1 CKO+Rapa组较Control+Rapa组未淬灭LC3-GFP荧光增强(P<0.05).C28/I2细胞中过表达CHERP降低LC3荧光强度,过表达IRE1α增强LC3荧光表达并能部分挽救CHERP导致的荧光降低情况.结论 IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白,升高胞内钙离子含量,进一步导致软骨细胞的自噬功能受损.

IRE1α;自噬流;钙离子;内质网钙稳态蛋白;软骨细胞

李星月;尹丹旸;范梦恬;杨玉有;梁利;冯乃波;李小丽;郭风劲

重庆医科大学基础医学院细胞生物学与遗传学教研室,重庆 400016;首都医科大学附属北京友谊医院病理科,北京 100011

南方医科大学学报

[1]李星月;尹丹旸;范梦恬;杨玉有;梁利;冯乃波;李小丽;郭风劲-.IRE1α缺陷通过上调内质网钙稳态蛋白降低软骨细胞的自噬功能)[J].南方医科大学学报,2022(06):785-793

内质网钙稳态蛋白,CHERP,8c+Rapa,ERN1,CKO,Bafilomycin,Control+Bafilomycin,CKO+Bafilomycin,Control+Rapa,CKO+Rapa

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