典型文献
利用CRISPR/Cas9技术体内标记示踪小鼠内源性NPC1L1蛋白
文献摘要：
目的:对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行标记和示踪,为研究体内胆固醇的吸收机制提供新的技术手段.方法:利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术,针对小鼠NPC1L1基因的3'末端非编码区,设计不同sgRNA,利用细胞内的荧光素酶法,检测分析其Cas9/sgRNA核酸酶活性,筛选出高活性的sgRNA序列,经体外转录制备sgRNA和Cas9 mRNA.PCR扩增基因打靶的两侧同源臂,与FLAG-EGFP的编码cDNA一起克隆至打靶载体.经酶切和测序鉴定正确的打靶载体DNA与sgRNA、Cas9 mRNA一起显微注射入小鼠受精卵,移植至假孕小鼠体内自然发育;通过基因组DNA的PCR和Southern印迹分析,筛选、鉴定重组正确且无随机插入的子代小鼠.制备小肠组织冰冻切片,荧光显微镜下观察NPC1L1-EGFP的表达分布.结果:成功构建了NPC1L1基因敲入打靶载体,筛选了高活性的sgRNA,利用CRISPR/Cas9技术获得了对内源性NPC1L1蛋白C端进行FLAG和EGFP双重标记的子代小鼠,荧光显微镜下观察到该融合蛋白分布于小肠绒毛上皮细胞的刷状缘,与NPC1L1的分布特征一致.结论:成功实现了对小鼠内源性NPC1L1蛋白进行体内标记,为研究NPC1L1囊泡转运和胆固醇吸收机制提供了有效手段.
文献关键词：
NPC1L1;CRISPR/Cas9;胆固醇吸收;示踪;转基因小鼠;标签蛋白
中图分类号：
作者姓名：
武晓静;陈玉霞;麻献华;章卫平
作者机构：
天津医科大学朱宪彝纪念医院,天津市内分泌研究所,国家卫健委激素与发育重点实验室,天津市代谢性疾病重点实验室,天津300134;海军军医大学基础医学院病理生理学教研室,上海200433
文献出处：
引用格式：
[1]武晓静;陈玉霞;麻献华;章卫平-.利用CRISPR/Cas9技术体内标记示踪小鼠内源性NPC1L1蛋白)[J].天津医科大学学报,2022(01):53-57,64
A类：
B类：
CRISPR,Cas9,内标,示踪,内源性,NPC1L1,内胆,吸收机制,基因组编辑技术,非编码区,sgRNA,荧光素酶,酶法,检测分析,核酸酶活性,高活性,体外转录,录制,基因打靶,FLAG,EGFP,cDNA,显微注射,射入,受精卵,假孕,Southern,机插,子代,冰冻切片,荧光显微镜,显微镜下,表达分布,基因敲入,技术获得,融合蛋白,小肠绒毛,上皮细胞,囊泡转运,胆固醇吸收,转基因小鼠,标签蛋白
AB值：
0.309217
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