为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的时间分辨荧光免疫法(TRFIA),本研究将原核表达的ASFV重组P54蛋白(rP54)包被酶联板,并将Eu3+标记rP54蛋白,经各反应条件的优化建立了双抗原夹心TRFIA.并确定该方法的cut-off值,绘制其标准曲线.结果显示,rP54最佳包被浓度为4μg/mL,100μL/孔;用150μL Eu3+标记试剂标记1 mg抗原;反应体系为30μL标准品(即不同浓度的ASFV P54蛋白MAb)或待测样品+200μL/孔Eu3+标记抗原+200μL/孔增强液.利用该方法检测100份健康猪血清样品得出该方法的cut off值为2.52 ng/mL.建立的标准曲线结果显示,ASFV P54抗体的线性范围为0.1 ng/mL～1000 ng/mL,R2=0.9930,表明该检测方法具有良好的剂量-反应效应.通过特异性、敏感性、重复性、稳定性试验评估了该方法的检测性能.将23份疑似ASF患病猪和20份健康猪口鼻咽拭子/血清样品同时采用本TRFIA、PCR法及ELISA方法检测,分别计算配对卡方检验(McNemar test)P值和一致性检验(Kappa test)的Kappa值,分析它们之间的一致性.采用该方法检测P54 MAb标准品与其他常见猪病毒阳性血清,结果显示除了P54 MAb标准品检测为阳性结果外,其余均为阴性结果,无明显交叉反应,特异性较强;通过标准曲线方程得出该方法对ASFV P54抗体的检测下限为0.067 ng/mL,敏感性较高;重复性试验结果显示,该方法批内变异系数小于10％,回收率在95.80％～105.62％;批间变异系数小于15％,回收率在92.50％～108.97％.组装的TRFIA试剂盒在37℃可以稳定保存7 d.对23份疑似ASF患病猪和20份健康猪口鼻咽拭子/血清样品检测,结果显示,TRFIA和PCR法同时检测出4份ASFV阳性样品,其余均为阴性样品,该方法与常规PCR法检测结果的McNemar test P值为1.00,Kappa值为1.00,提示TRFIA法与PCR法检测结果的一致性较高(符合率100％),准确性高于ELISA法.本研究首次建立了基于ASFV P54抗体的双抗原夹心TRFIA,且其具有定量、准确、特异性强、敏感性高等优点,为ASF的快速、精准检测提供新的技术手段.

非洲猪瘟病毒;抗体检测;双抗原夹心;时间分辨荧光免疫法

陈翠翠;钟树海;赖宏锐;梁焕坤;郭桂玲;李来庆

广州优迪生物科技股份有限公司,广东 广州 510663

中国预防兽医学报

[1]陈翠翠;钟树海;赖宏锐;梁焕坤;郭桂玲;李来庆-.非洲猪瘟病毒抗体时间分辨免疫荧光方法的建立及初步应用)[J].中国预防兽医学报,2022(03):284-288,319

rP54

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