典型文献
NDRG1干扰载体的构建及稳定过表达NDRG1人脑微血管内皮细胞的建立
文献摘要：
目的:构建N-myc下游调节基因1(NDRG1)的shRNA干扰载体和过表达载体,转染人脑微血管内皮细胞(hCMECs)后验证干扰和过表达效果并获得稳定过表达NDRG1的细胞.方法:将pGPU6-GFP质粒采用BamHⅠ和BbsⅠ双酶切后,分别与设计的8条shRNA连接构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体,经测序鉴定后采用Lipofectamine 2000转染hCMECs,采用荧光显微镜观察载体转染效率,将PCR扩增的NDRG1编码区序列与pMD19-T连接,经测序正确后将重组质粒与pcDNA3.1空质粒采用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ双酶切,连接后构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体,采用Lipofectamine 2000将测序正确的过表达载体转染hCMECs,采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)法检测干扰和过表达的hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平,Western blotting法检测hCMECs中NDRG1蛋白表达水平,采用新霉素筛选出阳性克隆hCMECs.结果:pGPU6-GFP载体经双酶切后,电泳结果显示完全线性化,测序结果显示shRNA均成功连接至pGPU6-GFP载体;荧光显微镜观察载体转染效率约为70％;RT-qPCR法检测,有3个shRNA干扰载体的干扰效果良好,转染后hCMECs中NDRG1 mRNA表达水平分别约为对照组的26％、21％和13％;Western blotting法检测到对应的特异性蛋白条带,重组质粒pcDNA3.1-NDRG1经双酶切后,电泳结果可见大小为1185和5428 bp的2条DNA条带,测序结果显示NDRG1基因成功插入,成功制备阳性克隆hCMECs.RT-qPCR法检测,阳性克隆hCMEC中NDRG1 mRNA表达水平较对照组升高,约为对照组的25.96倍;Western blotting法检测,hCMEC中NDRG1蛋白表达水平较对照组升高.结论:成功构建pGPU6-GFP-NDRG1 shRNA干扰载体并验证干扰效果;成功构建pcDNA3.1-NDRG1过表达载体和稳定过表达NDRG1的hCMECs.
文献关键词：
N-myc下游调节基因1;RNA干扰;真核表达载体;过表达;人脑微血管内皮细胞
中图分类号：
作者姓名：
阮婷玉;史唯地;马勋;王静;康立超;杜冬冬;殷月兰
作者机构：
石河子大学动物科技学院预防兽医实验室,新疆 石河子 832003;新疆农垦科学院分析测试中心,新疆 石河子 832000;江苏省人兽共患病学重点实验室,江苏 扬州 225009
文献出处：
引用格式：
[1]阮婷玉;史唯地;马勋;王静;康立超;杜冬冬;殷月兰-.NDRG1干扰载体的构建及稳定过表达NDRG1人脑微血管内皮细胞的建立)[J].吉林大学学报（医学版）,2022(06):1614-1622
A类：
hCMECs,Bbs
B类：
NDRG1,干扰载体,人脑微血管内皮细胞,myc,shRNA,过表达载体,表达效果,pGPU6,GFP,BamH,双酶,Lipofectamine,荧光显微镜观察,转染效率,编码区,pMD19,重组质粒,pcDNA3,限制性内切酶,Hind,qPCR,blotting,蛋白表达水平,新霉素,电泳,全线,线性化,干扰效果,白条,条带,bp,真核表达载体
AB值：
0.159611
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