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菘蓝木脂素糖基转移酶体外催化根皮素的酶学研究
文献摘要：
体外酶促反应发现前期克隆的菘蓝木脂素糖基转移酶UGT236(属于UGT71B家族)能高效催化根皮素生成根皮昔.UGT236与苹果中的P2'GT同源性较高,同属UGT71家族.该研究将重组质粒pET-28a-MBP-UGT236转人大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞,通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,并通过纯化获得较高纯度的UGT236蛋白,以根皮素为底物,研究其酶学性质.结果显示,UGT236最适反应温度为40℃,最适反应pH为8(Na2HP04-NaH2PO4体系).金属离子影响实验表明,Ni2+、Al3+对UGT236有一定抑制作用,Fe2+、Co2+、Mn2+3种离子均能提高UGT236的活性,而Mg2+、Ca2+、Li+、Na+、K+对UGT236 的活性没有影响.酶动力参数实验测得根皮素的Km为61.03 μmol·L-1,Kcat为0.01 s-1,Kcat/Km 为 157.11 mol-1·s-1·L,UDPG 的 Km为 183.6 μmol·L-1,Kcat 为 0.01 s-1,Kcat/Km 为 51.91 mol-1·s-1?L.通过同源建模、分子对接筛选出部分可能的活性位点,对其进行突变及活性检测鉴定了 3个关键的活性位点Glu391、His15、Thr141,而位点Phe146则和产物的多样性有关.该研究发现菘蓝中木脂素类糖基转移酶UGT236能催化根皮素生成根皮苷,对其酶学性质进行了探究,通过结构预测、分子对接和突变验证发现了几个关键的氨基酸残基,为根皮素糖苷产物的专一性和多样性催化提供了一定依据,可为后续通过改造获得高效和专一性催化的人工糖基转移酶元件提供参考.
文献关键词：
菘蓝;糖基转移酶;根皮素;酶学性质分析;分子对接;突变
中图分类号：
作者姓名：
姜银银;谭宇萍;孙术富;杨健;郭娟;唐金富
作者机构：
中国中医科学院中药资源中心 道地药材国家重点实验室培育基地,北京100700
文献出处：
引用格式：
[1]姜银银;谭宇萍;孙术富;杨健;郭娟;唐金富-.菘蓝木脂素糖基转移酶体外催化根皮素的酶学研究)[J].中国中药杂志,2022(15):4074-4083
A类：
木脂素糖基转移酶,UGT236,UGT71B,UGT71,Na2HP04,Mn2+3,UDPG,Glu391,His15,Thr141,Phe146
B类：
菘蓝,根皮素,体外酶促反应,高效催化,苹果,P2,同源性,同属,重组质粒,pET,28a,MBP,大肠杆菌,Rosetta,DE3,感受态,异丙基,半乳糖,糖苷,isopropyl,thiogalactoside,IPTG,诱导表达,高纯度,底物,反应温度,NaH2PO4,金属离子,Ni2+,Al3+,Fe2+,Co2+,Mg2+,Ca2+,Li+,Na+,K+,动力参数,Km,Kcat,同源建模,分子对接,活性位点,活性检测,检测鉴定,木脂素类,根皮苷,结构预测,氨基酸残基,专一性,酶学性质分析
AB值：
0.270851
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