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新型冠状病毒木瓜样蛋白酶在大肠杆菌中的可溶表达与酶活性测定
文献摘要：
目的 制备高活性的新型冠状病毒木瓜样蛋白酶(papain-like protease,PLpro),为PLpro小分子抑制剂高通量筛选模型的建立奠定基础.方法 将密码子优化的新型冠状病毒PLpro基因连接到pET-28a载体中,构建重组质粒pET-28a-PLpro.将重组质粒转化到Escherichia coli Rosetta(DE3)感受态细胞中,以十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)鉴定PLpro的原核表达.采用低温诱导策略进行PLpro的可溶表达后,以HisTrapTM亲和层析柱分离纯化PLpro,再以荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)法测定PLpro的米氏常数(Michaelis constant,Km)值及其水解活性.结果 基因测序与双酶切试验结果表明,成功构建了重组质粒pET-28a-PLpro.SDS-PAGE结果表明,PLpro在大肠杆菌中呈可溶表达,且纯化的PLpro纯度＞90％.FRET结果表明,纯化的PLpro具有良好的水解活性,其Km值为25.38μmol·L-1.结论 新型冠状病毒PLpro在大肠杆菌中成功地进行了可溶表达,且具有良好的酶活性.
文献关键词：
新型冠状病毒;木瓜样蛋白酶;原核表达;亲和层析;荧光共振能量转移
中图分类号：
作者姓名：
闫干干;李淼;戚海燕;刘志成;闫浩浩;刘晓丽;刘晓平;陈云雨
作者机构：
皖南医学院/药物筛选与评价研究所,安徽芜湖241002;长春生物制品研究所,长春130012
文献出处：
引用格式：
[1]闫干干;李淼;戚海燕;刘志成;闫浩浩;刘晓丽;刘晓平;陈云雨-.新型冠状病毒木瓜样蛋白酶在大肠杆菌中的可溶表达与酶活性测定)[J].中国现代应用药学,2022(01):5-11
A类：
HisTrapTM
B类：
木瓜样蛋白酶,大肠杆菌,酶活性测定,高活性,papain,like,protease,PLpro,小分子抑制剂,高通量筛选,筛选模型,密码子优化,接到,pET,28a,重组质粒,Escherichia,coli,Rosetta,DE3,感受态,十二烷基磺酸钠,聚丙烯酰胺凝胶电泳,SDS,PAGE,原核表达,诱导策略,亲和层析,层析柱,分离纯化,再以,荧光共振能量转移,fluorescence,resonance,energy,transfer,FRET,Michaelis,constant,Km,水解活性,基因测序,双酶
AB值：
0.302967
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