[背景]16S rRNA基因扩增子测序技术是一种不依赖培养而获得样本中细菌种群结构、相对丰度等信息的方法.高通量测序技术实验步骤较多,每一步骤细微的差别都可能在最终的测序结果中放大,并造成测序结果与实际情况的偏差.[目的]基于MiSeq测序平台,探讨PCR反应体系中扩增引物序列、退火温度、模板起始量、扩增循环数和变性时间等5个因素对16S rRNA基因测序结果的影响.[方法]对mockDNA的16SrRNA基因扩增子进行测序,分别分析不同的扩增引物、退火温度、模板起始量、循环数和变性时间对数据准确性的影响.[结果]不同的扩增引物对检测结果有较大的影响,采用的4组引物中,引物B(V3-V4,341F/806R)的准确性最好,引物A(V3-V4,341F/805R)次之.比较不同退火温度(52、55和60℃)对检测准确性的影响,退火温度60℃的结果最接近理论值.模板起始量(2、10和50 ng)的检测结果显示,mock DNA起始量为2 ng的结果准确性最高.相较于其他3组(15+18、25+8和30+8),循环数为(20+8)的检测结果最接近mockDNA的理论值.不同变性时间(3 min和5 min)对分析结果无显著性影响.[结论]引物序列、退火温度、模板起始量和循环数是影响16S rRNA基因测序结果准确性的重要因素.

16S rRNA基因;反应条件;靶向测序

赵枫;史亚;王莹;梁倩;陈欢;李樱红;窦晓兵;何陆平

浙江中医药大学生命科学学院,浙江杭州310053;杭州微数生物科技有限公司,浙江杭州311215;浙江省食品药品检验研究院国家药品监督管理局药品微生物检测与预警重点实验室,浙江杭州310052

微生物学通报

[1]赵枫;史亚;王莹;梁倩;陈欢;李樱红;窦晓兵;何陆平-.PCR反应条件对16S rRNA基因扩增子测序准确性的影响)[J].微生物学通报,2022(07):2527-2537

mockDNA,341F,805R,15+18,25+8,30+8

反应条件,基因扩增,扩增子测序,不依,细菌种群结构,相对丰度,高通量测序技术,实验步骤,细微,中放,MiSeq,测序平台,反应体系,扩增引物,退火温度,基因测序,16SrRNA,数据准确性,V3,V4,806R,检测准确性,近理,理论值,结果准确性,20+8,果无,靶向测序

0.236756