目的 建立豆状囊尾蚴体外长期培养方法,并对其培养分泌产物进行鉴定.方法 将豆状带绦虫虫卵经口感染新西兰白兔(2 000枚/只),感染后3个月,从感染兔腹腔中收集豆状囊尾蚴.将虫体随机分为PBS组、RPMI1640组、胆汁组(RPMI1640+10％兔胆汁)和血清组(RPMI1640+10％无外泌体胎牛血清),10个/组,37℃、5％CO2培养后5min、1h、2h、12h、24 h、36 h、48 h及其后每天进行观察,记录豆状囊尾蚴头节翻出情况、虫体活力、体外存活时间及形态改变等,筛选适宜的培养条件.取50个幼虫在细胞瓶(25 cm2)中按筛选出的培养条件培养,每隔48小时收集培养液离心浓缩,取上清,蛋白质免疫印迹(Western blotting)检测豆状带绦虫烯醇化酶(Tpeno)和Tp14-3-3蛋白的表达情况.收集豆状囊尾蚴培养上清,提取外泌体,分别与阴性兔血清、CD63抗体、抗Tpeno单克隆抗体1D7和抗Tp14-3-3多克隆抗体孵育45 min,再加入胶体金标记的IgG,透射电镜观察外泌体形态,免疫电镜检测其标记蛋白CD63、Tpeno和Tp14-3-3表达情况.采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析,组间比较采用单因素方差分析.结果 培养前的豆状囊尾蚴呈椭圆形,有内凹的点状乳白色头节;PBS组可存活7d;RPMI 1640组可存活2个月;胆汁组存活时间最短,仅48h;血清组幼虫存活时间最长,可达3个月以上,高于其他3个组(P＜0.05).存活期内,PBS组、RPMI 1640组、胆汁组和血清组幼虫囊泡长度分别为(1.38±0.39)、(1.30±0.12)、(1.18±0.59)和(1.83±0.10)cm;宽度分别为(0.45±0.10)、(0.68±0.05)、(0.25±0.06)和(0.85±0.05)cm;血清组虫体囊泡长度和宽度与其余3组相比差异均有统计学意义(F长 度=7.58、65.93、7.11,F宽度=73.85、29.41、308.57,P＜0.05 或P＜0.01).培养 12 h 时,PBS组、RPMI 1640组、胆汁组和血清组幼虫头节翻出率分别为(33.3±5.8)％、(20.0±0.0)％、(100.0±0.0)％、(13.3±5.8)％,其中血清组与PBS和胆汁组头节翻出率差异有统计学意义(F=18.00、676.00,P＜0.01).对各组培养效果比较显示,血清组的培养液(RPMI 1640+10％无外泌体胎牛血清)为最适培养液.SDS-PAGE电泳分析结果显示,利用RPMI 1640+10％无外泌体胎牛血清培养豆状囊尾蚴,可成功提取到虫体的代谢_分泌产物和外泌体蛋白.Western blotting分析结果显示,用特异性抗体检测可见Tpeno和Tp14-3-3阳性条带,相对分子质量(Mr)分别约47 000和28 000,与预期相符.透射电镜下豆状囊尾蚴外泌体大小不一,直径为50～150 nm,为圆形或椭圆形的囊泡.免疫电镜分析显示,阴性兔血清不能识别外泌体蛋白,未见胶体金颗粒标记;外泌体标志蛋白CD63、虫体特异性蛋白Tpeno和Tp14-3-3均为阳性表达,胶体金颗粒标记明显.结论 初步建立了豆状囊尾蚴体外培养体系,可连续培养豆状囊尾蚴至少3个月以上.采用该体外培养方法培养可在培养上清中成功提取豆状囊尾蚴的外泌体.

豆状囊尾蚴;体外培养;长期;分泌产物;免疫电镜

张少华;刘婷丽;骆学农;王帅;郭爱疆;白雪;陈国梁;才学鹏

中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室,兰州730046;吉林大学动物医学学院、人兽共患病研究所,人兽共患病研究教育部重点实验室,长春130062

中国寄生虫学与寄生虫病杂志

[1]张少华;刘婷丽;骆学农;王帅;郭爱疆;白雪;陈国梁;才学鹏-.豆状囊尾蚴体外培养方法的建立及其分泌产物的分离鉴定)[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2022(04):500-506

豆状囊尾蚴,RPMI1640+10,Tpeno,Tp14,1D7,1640+10

培养方法,分泌产物,分离鉴定,外长,带绦虫,虫虫,虫卵,经口,新西兰白兔,虫体,PBS,胆汁,外泌体,胎牛血清,5min,1h,12h,翻出,外存,存活时间,形态改变,培养条件,幼虫,每隔,培养液,上清,蛋白质免疫印迹,blotting,烯醇化酶,养上,CD63,单克隆抗体,多克隆抗体,孵育,胶体金,金标记,IgG,透射电镜,电镜观察,免疫电镜,单因素方差分析,椭圆形,点状,乳白色,7d,时间最短,48h,存活期,囊泡,体囊,组头,组培,培养效果,效果比较,SDS,PAGE,电泳分析,取到,特异性抗体,抗体检测,条带,相对分子质量,Mr,大小不一,电镜分析,阳性表达,体外培养体系,连续培养,方法培养

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