为在猪链球菌(S.suis)中引入高效的反向筛选标记,本研究根据S.suis密码子偏好性优化了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)蔗糖果聚糖酶基因sacB的密码子,并由公司合成后作为模板,采用PCR扩增sacB基因片段;采用PCR从相应模板中分别扩增S.suis中的启动子序列(Peno)及含壮观霉素抗性基因(spc)的片段;再经重叠延伸PCR扩增融合基因片段Peno-sacB-spc(PSS).以相应模板及引物分别经PCR扩增S.suis mapZ基因待融合位点上下游序列UP1和DN1及其pbp1b基因待融合位点上下游序列UP2和DN2、含正/反向筛选标记的片段PSS1和PSS2基因片段,以及用于替换PSS片段的绿色荧光蛋白(GFP)gfp1和gfp2基因片段;再分别通过重叠延伸PCR扩增构建中间菌株的融合片段UP1-PSS1-DN1、UP2-PSS2-DN2以及构建GFP融合菌株的融合片段UP1-GFP1-DN1、UP2-GFP2-DN2.采用同源重组的方法将UP1-PSS1-DN1和UP2-PSS2-DN2分别转化S.suis 05ZYH33菌株,经壮观霉素筛选引入PSS的中间菌株.PCR及测序鉴定结果表明获得了引入PSS片段的中间菌株PSS-mapZ和PSS-pbp1b.将WT、PSS-mapZ和PSS-pbp1b分别培养于含不同浓度蔗糖(10％、7.5％、5％和2.5％)的TSAS平板上,确定WT生长而PSS-mapZ和PSS-pbp1b中间菌株不生长的蔗糖浓度(用于筛选及构建GFP融合菌株).通过比较分析最终确定反向筛选GFP融合菌株的最适蔗糖浓度约为7％.通过同源重组的方法分别将UP1-GFP1-DN1片段转化PSS-mapZ菌株、UP2-GFP2-DN2片段转化PSS-pbp1b菌株,分别经含7％蔗糖(生长)及含壮观霉素(不生长)的TSAS平板筛选.随机选择经筛选获得的100个单菌落计算筛选的阳性率.各取6个单菌落经PCR及测序鉴定.结果显示,筛选菌株的阳性率在52％～75％.PCR及测序结果显示,获得的两种重组菌株中的gfp基因片段确实分别替换了PSS-mapZ和PSS-pbp1b中的相应PSS,表明正确构建了融合GFP的重组菌株GFP-mapZ和GFP-pbp1b.本研究首次构建了高效的正/反向筛选标记PSS,以及无痕的S.suis GFP-mapZ和GFP-pbp1b融合菌株,为快速无痕的S.suis遗传操作及深入研究S.suis相关分子机制奠定了基础.

猪链球菌;无痕突变;sacB基因;反向筛选标记

卫东;陈平;高广娟;朱金鲁;武柳君;刘思国;张跃灵

中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病创新团队,黑龙江 哈尔滨 150069

中国预防兽医学报

[1]卫东;陈平;高广娟;朱金鲁;武柳君;刘思国;张跃灵-.利用sacB基因反向筛选法构建GFP分别融合于猪链球菌MapZ及PBP1b蛋白的融合菌株)[J].中国预防兽医学报,2022(11):1149-1155

MapZ,PBP1b,反向筛选标记,果聚糖酶,Peno,mapZ,pbp1b,UP2,PSS1,PSS2,gfp1,gfp2,GFP1,GFP2,05ZYH33,TSAS,无痕突变

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