目的·探究腺相关病毒血清型8型(adeno-associated virus serotype 8,AAV8)介导的野生型缝隙连接蛋白β2(gap junctionprotein β2,Gjb2)基因在Gjb2基因c.109G＞A纯合突变小鼠(简称Gjb2纯合突变小鼠)耳蜗支持细胞区域的表达情况及安全性,以及对呋塞米引起的听力下降的影响.方法·将带有绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的AAV8-GFP病毒,经耳蜗中阶注射入新生Gjb2纯合突变小鼠的内耳,注射14 d后取小鼠耳蜗,荧光显微镜观察基底膜GFP的表达情况.将载有野生型Gjb2基因的AAV8-GJB2-GFP病毒经中阶注射入新生Gjb2纯合突变小鼠内耳后,于4周后通过实时荧光定量PCR和Western blotting检测耳蜗Gjb2mRNA及其编码的连接子蛋白(connexin 26,CX26)的表达水平,通过免疫荧光法观察其具体表达位置.通过听性脑干反应(auditory brainstem response,ABR)实验评价新生纯合突变小鼠中阶注射AAV8-GJB2-GFP后4周龄时5.66～45.00kHz的听力阈值.采用呋塞米试验比较野生型小鼠及Gjb2纯合突变小鼠腹腔注射呋塞米前后的ABR阈值变化,以及观察Gjb2纯合突变小鼠经AAV8-GJB2-GFP治疗后能否缓解呋塞米导致的听力下降.结果·AAV8-GFP注射14d后耳蜗顶圈、中圈、底圈支持细胞的转染率分别为(11.60±1.28)％、(10.33±1.55)％、(5.40±0.86)％.AAV8-GJB2-GFP注射4周后耳蜗Gjb2mRNA水平约为未注射耳的1.26倍(P=0.014),CX26蛋白水平是未注射耳的1.31倍(P=0.001);注射后通过荧光显微镜观察到耳蜗支持细胞表达CX26,内毛细胞区域也有CX26异位表达.ABR检测显示,给药耳各频率听力阈值与对侧耳无明显差异,表明其安全性较好.Gjb2纯合突变小鼠经呋塞米诱导后较野生型小鼠产生更明显的听力阈移,注射AAV8-GJB2-GFP4周后突变小鼠阈移小于未治疗小鼠,在8.00、11.32、16.00kHz测得的阈值,2组间差异均有统计学意义(均P＜0.05).结论·在新生Gjb2纯合突变小鼠中阶注射AAV8-GJB2-GFP,可使小鼠成年后耳蜗支持细胞表达外源性Gjb2,挽救呋塞米诱导的听力下降.

腺相关病毒;缝隙连接蛋白β2;支持细胞;呋塞米;基因治疗

上海交通大学医学院附属第九人民医院耳鼻咽喉头颈外科,上海200011;上海市耳鼻疾病转化医学重点实验室,上海200125;上海交通大学医学院耳科学研究所,上海200125

[1]成桢哲;金晨曦;冯宝怡;郑晓飞;刘祎晴;吴皓;陶永-.基于腺相关病毒血清型8型介导的Gjb2基因c.109G＞A纯合突变耳聋小鼠的基因治疗)[J].上海交通大学学报（医学版）,2022(06):735-741

Gjb2,junctionprotein,Gjb2mRNA,CX26,00kHz,GFP4

腺相关病毒,毒血,血清型,109G,纯合突变,耳聋,基因治疗,adeno,associated,virus,serotype,AAV8,野生型,缝隙连接蛋白,gap,耳蜗,支持细胞,呋塞米,听力下降,绿色荧光蛋白,green,fluorescent,射入,内耳,荧光显微镜观察,基底膜,载有,GJB2,blotting,连接子,connexin,免疫荧光法,听性脑干反应,auditory,brainstem,response,ABR,实验评价,周龄,听力阈值,小鼠腹腔,腹腔注射,14d,中圈,转染,内毛细胞,异位表达,对侧,侧耳,外源性,挽救

0.219569