目的:为提高COVID-19检测灵敏度,减少新冠患者临床假阴性检测结果,本研究建立了一种SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA捕获方法.方法:利用链霉亲和素磁珠,设计并合成生物素探针捕获SARS-CoV-2假病毒RNA;对磁珠用量、生物素探针浓度和洗脱次数等捕获条件进行了优化;参考WHO发布的序列,针对SARS-CoV-2病毒基因组的ORF1ab基因和N基因序列合成引物和TaqMan探针,对捕获的SARS-CoV-2假病毒RNA进行反转录实时荧光定量PCR检测.采用一步法和分步法检测、单重和多重实时荧光定量PCR检测,并分别比较检测结果.结果:本研究设计的生物素探针能富集到距离探针结合位点至少1.8 K处的序列,在生物素探针浓度12.5 μM,磁珠的工作浓度333.33 μg/mL时,合并RNA的两次洗脱液,对低拷贝病毒RNA的捕获效率最高.研究得到对低拷贝病毒RNA分步法比一步法、多重比单重实时荧光定量PCR检测更灵敏,进行分步法、多重实时荧光定量PCR检测限低于10 copies/μL,组间和重复实验组之间CT值变异系数均小于1％.所有阴性对照样品在检测中均为阴性.结论:本研究优化的链霉亲和素磁珠-生物素探针捕获法是富集SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA的有效方法,其抽提RNA病毒的结果优于一些商业化试剂盒,分步法、多重实时荧光定量PCR对SARS-CoV-2低拷贝假病毒RNA实现了高效检测,这为临床检测低拷贝RNA病毒提供了一种参考方案.

SARS-CoV-2假病毒;链霉亲和素磁珠;生物素探针;多重实时荧光定量PCR

余佳;李晓宁;肖君华;李凯;周宇荀

东华大学化学化工与生物工程学院 上海201620

现代生物医学进展

[1]余佳;李晓宁;肖君华;李凯;周宇荀-.低拷贝病毒RNA捕获及多重实时荧光定量PCR检测)[J].现代生物医学进展,2022(20):3806-3812

生物素探针

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