背景:目前CRISPR/Cas9结合Cre-loxP技术制备溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)基因敲除小鼠的实验方法非常少见.目的:运用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠基因组中BRD4基因片段,构建BRD4基因敲除小鼠.方法:根据BRD4基因的外显子序列,设计一段gRNA并合成.gRNA体外转录后和Cas9 mRNA以及含loxp位点的质粒共同注射入受精卵细胞中,Cas9通过识别gRNA先导链切割目的片段,然后loxp插入到切割位点,在与Cre配种后,Cre酶会切割loxp位点实现最终的特异性删除效果.注射后的受精卵细胞移植至C57BL/6N雌性小鼠获得子代小鼠,对子代小鼠进行测序鉴定其基因型.将成功导入loxp位点的小鼠BRD4-loxP+/-(F0代)与野生型C57BL/6N小鼠配繁后筛选可稳定遗传的小鼠BRD4-loxP+/-(F1代),BRD4-loxP+/-小鼠一部分互相交配,一部分与CAGGCre-ERTM鼠交配,获得BRD4-loxP+/+小鼠和BRD4-loxP+/-、CAGGCre-ERTM共表达的小鼠(F2代);F2代小鼠互相交配可以获得纯合子BRD4-loxP+/+、CAGGCre-ERTM小鼠.将6-8周纯合子小鼠腹腔注射它莫昔芬75 mg/kg(溶于玉米油中),连续7 d即可完成BRD4基因的诱导敲除.取基因敲除后的小鼠尾部片段,吸附柱法提取DNA,通过琼脂糖凝胶电泳检测BRD4基因片段在小鼠尾部组织中的表达.结果 与结论:①通过PCR筛选鉴定出F1代小鼠7,8,9,10,12,14,16,19,20,21,25,42,43和47号小鼠为成功插入2条loxP片段等位基因的杂合型小鼠;②F2代交互繁育出的F3代纯合子用它莫昔芬诱导后,经PCR凝胶电泳验证表明纯合子小鼠中BRD4基因片段被成功敲除;③提示利用CRISPR/Cas9技术结合Cre-loxP技术成功构建出了BRD4基因敲除小鼠.

CRISR/Cas9;Cre-loxP;BRD4;基因敲除;小鼠;它莫昔芬

王向宇;朱睿智;赵志平;张聿达;张永涛;王昌耀

青岛大学医学部,山东省青岛市 266071;黄冈市中心医院,湖北省黄冈市 438000;青岛大学附属医院,山东省青岛市 266071

中国组织工程研究

[1]王向宇;朱睿智;赵志平;张聿达;张永涛;王昌耀-.CRISPR/Cas9结合Cre-loxP技术制备溴结构域蛋白4基因敲除小鼠)[J].中国组织工程研究,2022(32):5179-5184

loxP+,CAGGCre,ERTM,它莫昔芬,CRISR

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