目的 构建并鉴定刚地弓形虫RH株巨噬细胞迁移抑制因子(Tgmif)基因敲除虫株.方法 设计刚地弓形虫RH株Tgmif的单向导RNA(sgRNA)和点突变引物,将pSAG1::Cas9-U6::sgUPRT质粒定点突变为针对Tgmif基因的pSAG1::Cas9-U6::sgTgmif质粒.构建含有Tgmif上游1 001 bp(Tgmif-up)、二氢叶酸还原酶-胸苷酸合成酶基因(dhfr-ts)和Tgmif下游1 011 bp(Tgmif-down)等3个片段的Tgmif供体质粒,从Tgmif供体质粒PCR扩增获得Tgmif供体DNA.将pSAG1::Cas9-U6::sgTgmif质粒和Tgmif供体DNA混合后电击转染野生型刚地弓形虫RH株(RHWT)速殖子,用乙胺嘧啶培养7d,筛选获得稳定表达乙胺嘧啶抗性的虫株并进行单克隆筛选,PCR扩增dhfr-ts上、下游同源臂和Tgmif鉴定Tgmif基因敲除单克隆株(RHΔTgmif).提取RHΔTgmif和RHWT株虫体蛋白,蛋白质免疫印迹(Western blotting)分析TgMIF蛋白的表达情况.RHΔTgmif在人包皮成纤维(HFF)细胞中传代10代,吉氏染色,镜检计数100个HFF中速殖子数,评估RHΔTgmif 在体外培养HFF细胞中的增殖能力,以RHWT为对照.将20只BABL/c小鼠随机分为RHWT组和RHΔTgmif 组(10只/组),各组分别腹腔注射RHWT或RHΔTgmif 株速殖子(1 000个/鼠),记录小鼠生存情况.弓形虫增殖能力的比较采用独立样本t检验,小鼠生存率的比较采用Log Rank检验.结果 PCR检测结果显示,含Tgmif-up、dhfr-ts和Tgmif-down等3个片段的Tgmif供体DNA片段长5 049 bp,与预期相符;RHΔTgmif株分别扩增出1 387、1 524 bp的dhfr-ts上、下游同源臂条带,RHWT株无相应条带;RHWT株扩增出1 837 bp的Tgmif条带,RHΔTgmif株无相应条带.Western blotting分析结果显示,RHWT株在相对分子质量(Mr)12 500处出现1条蛋白条带,RHΔTgmif株无相应的蛋白条带.吉氏染色镜检结果显示,100个HFF中RHΔTgmif株速殖子为(2 986±69.20)个,高于RHWT株的(2 067±51.08)个(t=18.50,P＜0.01).体内毒力试验结果显示,RHWT组小鼠在第7天出现死亡,在第9天全部死亡;RHΔTgmif组小鼠在第5天出现死亡,第7天全部死亡,两组之间的差异有统计学意义(x2=17.45,P＜0.01).结论 成功构建Tgmif基因敲除弓形虫虫株RHΔTgmif,RHΔTgmif株的毒力比RHWT株强.

刚地弓形虫;巨噬细胞迁移抑制因子;基因敲除

王杰;温红阳;陈滢;安然;罗庆礼;沈继龙;都建

安徽医科大学基础医学院生化与分子生物学教研室,合肥230032;人畜共患病安徽高校省级重点实验室,合肥230032;安徽医科大学基础医学院感染性疾病研究中心,合肥230032;病原生物学安徽省重点实验室,合肥230032

中国寄生虫学与寄生虫病杂志

[1]王杰;温红阳;陈滢;安然;罗庆礼;沈继龙;都建-.刚地弓形虫巨噬细胞迁移抑制因子基因敲除虫株的构建与鉴定)[J].中国寄生虫学与寄生虫病杂志,2022(03):349-354

Tgmif,pSAG1,sgUPRT,sgTgmif,dhfr,RHWT,TgMIF

刚地弓形虫,巨噬细胞迁移抑制因子,基因敲除,除虫,向导,sgRNA,引物,Cas9,U6,质粒,定点突变,bp,up,二氢叶酸,还原酶,胸苷酸合成酶,合成酶基,酶基因,ts,down,供体,电击,转染,野生型,乙胺,嘧啶,7d,稳定表达,单克隆,虫体蛋白,蛋白质免疫印迹,blotting,包皮,HFF,传代,中速,体外培养,BABL,腹腔注射,生存情况,Log,Rank,段长,条带,无相,相对分子质量,Mr,白条,内毒,毒力试验,天全,x2,虫虫

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