典型文献
基于原生质体的谷子CRISPR/Cas9基因编辑系统优化
文献摘要：
为了优化和筛选谷子中高效的 CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISRP-associated nuclease 9)基因编辑系统,针对谷子八氢番茄红素脱氢酶基因(SiPDS)设计6种gRNA(gRNA1—gRNA2针对外显子1,gRNA3—gRNA6针对外显子12),构建多种CRISPR/Cas9基因编辑系统,通过聚乙二醇(PEG)介导的方法转入谷子原生质体中,然后利用开发的大规模平行测序技术快速检测它们对SiPDS的突变效率.结果表明,采用7 d谷子黄化苗幼茎建立的原生质体转化系统的转化效率较高,为50.44％～57.36％.将Super启动子(SP)、谷子内源的泛素启动子(Ubi)分别驱动Cas9基因的基因编辑系统转入谷子原生质体中,发现两者对SiPDS基因的突变效率分别为0.5％、5.5％.随后采用Ubi启动子驱动Cas9基因,比较单一gRNA、双gRNA和tRNA结构的基因编辑系统对SiPDS基因的突变效率,发现双gRNA基因编辑系统Ubi-dgRNAE1和Ubi-dgRNAE12的突变效率分别较单一gRNA基因编辑系统提高了1.66倍和1.11倍;tRN A基因编辑系统Ubi-tRNA的突变效率较单一gRNA基因编辑系统提高了 5.87倍,为51.24％,且Ubi-tRNA可同时针对多个位点进行编辑,其多位点突变频率为3.23％.比较gRNA3、gRNA4、gRNA5体外转录产物分别与Cas9蛋白混合制成的核糖核蛋白(RNP)复合物的体外切割活性,发现RNP-gRNA5复合物体外切割活性最高,其对SiPDS基因的突变效率是2.0％,并且引起的突变类型主要为小于3 bp的缺失.
文献关键词：
基因编辑;CRISPR/Cas9;tRNA;RNP;谷子;原生质体
中图分类号：
作者姓名：
刘光宇;徐晓静;夏科科;孙海汐;陶月如;崔震;顾颖
作者机构：
深圳华大生命科学研究院,广东深圳518083
文献出处：
引用格式：
[1]刘光宇;徐晓静;夏科科;孙海汐;陶月如;崔震;顾颖-.基于原生质体的谷子CRISPR/Cas9基因编辑系统优化)[J].河南农业科学,2022(01):34-42
A类：
CRISRP,SiPDS,gRNA1,gRNA2,gRNA3,gRNA6,dgRNAE1,dgRNAE12,tRN,gRNA4,gRNA5
B类：
于原生,原生质体,谷子,CRISPR,Cas9,基因编辑,系统优化,Clustered,regularly,interspaced,short,palindromic,repeats,associated,nuclease,八氢番茄红素脱氢酶,酶基因,外显子,聚乙二醇,PEG,转入,大规模平行测序,快速检测,变效,黄化,幼茎,转化系统,转化效率,Super,启动子,泛素,Ubi,tRNA,时针,个位,多位点,位点突变,突变频率,体外转录,混合制,核糖,核蛋白,RNP,复合物,外切,切割活性,bp
AB值：
0.255266
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