α3β4烟碱型乙酰胆碱受体(nicotinic acetylcholine receptors,nAChRs)是成瘾、癌症和肥胖等重要疾病的潜在新靶点.本研究对大鼠(rat,r)α3β4 nAChRs的α3亚基上的3个氨基酸位点同时进行突变,将这3个位点分别突变为rα6亚基上与α3亚基上相对应的氨基酸种类,构建α3[K152E,E184D,Q195T]β4三点突变型受体,并研究其功能.利用PCR介导的定点突变方法构建了 α3[K152E,E184D,Q195T]三点突变体载体,体外转录获得相应的cRNA,与野生型β4亚基的cRNA按相同比例注射到非洲爪蟾卵母细胞中进行重组表达,然后用双电极电压钳技术检测其受体活性和功能.测定α3β4 nAChRs野生型和突变型在乙酰胆碱、尼古丁和金雀花碱3种不同激动剂的诱导下,其配体门控电流的大小以及门控特征,比较野生型和突变型受体之间的功能差异.α3[K152E,E184D,Q195T]三点突变体的功能与野生型相比存在显著差异.乙酰胆碱、尼古丁和金雀花碱对α3β4 nAChR野生型的半数最大效应浓度(EC50)分别为277.5、34.02和23.05 μmol·L-1;针对三点突变体,3种激动剂的EC50分别为170.5、26.6和98.45 μmol·L-1.3种激动剂对突变体的EC50与野生型受体的EC50相比,其活性变化分别为0.6、0.8和4.3倍.其中突变型受体对金雀花碱的活性影响最显著,其激动剂活性下降了 77％.此外,与1 mmol·L-1 乙酰胆碱诱导的峰值电流幅度相比,金雀花碱对野生型和突变型α3β4 nAChRs的最大激动效率(Emax)从94.12％提升至155.08％.α3[K152E,E184D,Q195T]β4三点突变型明显降低了对金雀花碱的敏感性,但其最大激动电流幅度明显变大.三点突变型略微增强了对乙酰胆碱和尼古丁的敏感性,说明α3亚基上的这3个氨基酸对α3β4 nAChRs的配体结合功能影响较大,对不同激动剂的影响情况各异,这为今后探究α3β4 nAChRs重要受体的精细结构和功能以及相关疾病的发病机制研究提供了很好的线索.

PCR介导定点诱变;α3β4烟碱型乙酰胆碱受体突变型;电生理学功能研究;激动剂;通道开放分子机制

陈舒苗;于津鹏;张笑凡;朱晓鹏;罗素兰;长孙东亭

海南大学药学院,海南大学热带生物资源教育部重点实验室,海南海口 570228;广西大学医学院,广西南宁530004

药学学报

[1]陈舒苗;于津鹏;张笑凡;朱晓鹏;罗素兰;长孙东亭-.烟碱型乙酰胆碱受体α3[K152E,E184D,Q195T]β4突变型的构建及其功能研究)[J].药学学报,2022(04):1054-1062

K152E,E184D,Q195T,双电极电压钳,电生理学功能研究,通道开放分子机制

烟碱型乙酰胆碱受体,突变型,nicotinic,acetylcholine,receptors,nAChRs,成瘾,新靶点,rat,亚基,氨基酸位点,个位,氨基酸种类,定点突变,突变体,体外转录,cRNA,野生型,射到,非洲爪蟾,卵母细胞,重组表达,尼古丁,金雀花碱,激动剂,门控,功能差异,半数,EC50,活性变化,峰值电流,Emax,略微,功能影响,影响情况,精细结构,结构和功能,相关疾病,定点诱变,体突变

0.182968