目的 探讨M2巨噬细胞外泌体(M2 macrophage exosomes,M2-exo)对高糖高胰岛素条件下小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchyml stem cells,BMSCs)成骨分化及Hedgehog信号通路的影响.方法 诱导小鼠巨噬细胞系RAW 264.7向M2极化后,提取并鉴定M2-exo,检测BMSCs对外泌体的摄取内吞.将BMSCs分为正常对照组(Control组,使用不含胰岛素、不含M2-exo,且葡萄糖浓度为5.5 mmol/L成骨诱导培养基)、高糖高胰岛素组(HGI组,使用含25 mmol/L葡萄糖及174 nmol/L胰岛素的成骨诱导培养基)及高糖高胰岛素M2-exo干预组(HGI+M2-exo组,使用与HGI组相同的培养基,并分别添加6、30、60μg/mL的M2-exo),成骨诱导7 d后行碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色,成骨诱导14 d后行茜素红染色,评估各组BMSCs成骨分化能力.另取Control组、HGI组、HGI+30μg/mL M2-exo组BMSCs细胞,成骨诱导培养14 d后(qPCR)及成骨诱导21 d后(Western blot)检测成骨及Hedgehog信号通路相关基因及蛋白的表达.结果 成功诱导M2巨噬细胞极化,M2极化表面标志物CD206呈强阳性表达.M2-exo呈典型的类圆形双层膜性囊泡结构,粒径主要分布于50～125 nm之间(占总粒子数的99.14％),外泌体标志蛋白CD9、CD63和CD81呈阳性表达.免疫荧光显示M2-exo可被小鼠BMSCs摄取内化.成骨诱导7 d后,HGI组BMSCs的ALP活性低于Control组,经6μg/mL、30μg/mL及60μg/mL的M2-exo干预后,HGI+M2-exo组ALP活性有所逆转,与HGI组相比差异有统计学意义(P<0.05);成骨诱导14 d后,HGI组矿化结节数量较Control组减少,仅HGI+30μg/mL M2-exo组干预后其矿化水平高于HGI组(P<0.05).qPCR结果显示,HGI组成骨分化相关基因Alp、Runx2、Ocn及Hedgehog通路相关基因Gli1、Smo、Ptch1 mRNA水平与Control组相比均有不同程度的降低,而30μg/mL M2-exo干预可促进这些基因的上调,与HGI组相比差异有统计学意义(P<0.05);Western blot结果显示,HGI组成骨相关蛋白RUNX2、COL1A1及Hedgehog通路蛋白GLI1的表达下调,而经30μg/mL M2-exo干预可促进COL1A1及GLI1的表达上调,与HGI组相比差异有统计学意义(P<0.05).结论 高糖高胰岛素对BMSCs成骨分化具有抑制作用.M2-exo干预后,BMSCs的Hedgehog信号通路激活且成骨分化能力增强,提示M2-exo具有用于糖尿病骨修复的潜力.

M2巨噬细胞;外泌体;骨髓间充质干细胞;糖尿病;Hedgehog信号通路

张程;包丽荣;杨于桃;王智;李燕

口腔疾病研究国家重点实验室 国家口腔疾病临床医学研究中心 四川大学华西口腔医院 成都 610041;中山大学附属口腔医院·中山大学光华口腔医学院 广东省口腔医学重点实验室 广州 510055

四川大学学报（医学版）

[1]张程;包丽荣;杨于桃;王智;李燕-.M2巨噬细胞外泌体对高糖高胰岛素条件下小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响)[J].四川大学学报（医学版）,2022(01):63-70

HGI+M2,HGI+30

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