对于山羊(Capra hircus)地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus 2,ENTV-2)引起的羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor,ENT),目前已建立了RT-PCR结合限制性内切酶鉴定ENTV的方法以及RT-PCR和qPCR等检测方法,但是内源性逆转录病毒(endogenous retrovirus,ERVs)的存在可干扰结果的准确性.本研究通过生物信息学方法将ENTV-2与ERVs和绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)进行比对,寻找ENTV-2囊膜蛋白(envelope protein,env)基因的保守序列并设计1对特异性引物,通过优化反应条件而建立高分辨率熔解曲线(high resolution melting curve,HRM)检测方法.优化结果显示,最佳反应体系为:上下游引物各0.4μmol/L,模板1μL,styo9(2.5μmol/L)1μL,2×Premix Taq 10μL,补充ddH2O至终体积20μL;反应条件为:94℃2 min;94℃15 s,59℃15 s,72℃15 s,40个循环;之后进行熔解曲线分析.构建env基因重组阳性质粒作为标准品,对HRM方法的特异性、敏感性和重复性进行检测.结果显示,所建立的HRM方法的特异性强,与ENTV-2高度同源的ERVs无交叉反应;敏感性高,对env基因重组阳性质粒的最低检测限为82.7拷贝/μL;重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均<1％.对92份临床样品的阳性检出率为18.7％,与TaqMan检测方法的符合率为100％.本研究可为山羊地方性鼻内肿瘤病毒病的早期、快速检测提供技术支持.

山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2);高分辨率熔解曲线(HRM);检测方法

张靖鹏;江锦秀;林裕胜;游伟;刘道泉;毛坤明;江斌;胡奇林

福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福州350013;福州市动物疫病预防控制中心,福州350026;福清市畜牧兽医中心,福清350300

农业生物技术学报

[1]张靖鹏;江锦秀;林裕胜;游伟;刘道泉;毛坤明;江斌;胡奇林-.山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2)HRM检测方法的建立与应用)[J].农业生物技术学报,2022(12):2456-2463

地方性鼻内肿瘤病毒,ENTV,Enzootic,ERVs,绵羊肺腺瘤,Jaagsiekte,JSRV,styo9,Premix

山羊,HRM,建立与应用,Capra,hircus,nasal,tumor,enzootic,限制性内切酶,qPCR,内源性,性逆转,逆转录病毒,endogenous,retrovirus,生物信息学方法,腺瘤病,sheep,囊膜蛋白,envelope,protein,保守序列,特异性引物,优化反应,反应条件,高分辨率熔解曲线,high,resolution,melting,curve,反应体系,上下游,ddH2O,熔解曲线分析,基因重组,质粒,标准品,交叉反应,检测限,拷贝,重复性试验,阳性检出率,TaqMan,符合率,病毒病,快速检测

0.265196