[目的]本研究旨在筛选油菜秸秆高效降解菌株并对其降解特性进行分析,为油菜秸秆的资源化利用提供科学依据.[方法]采用稀释涂布平板法、刚果红透明圈试验以及纤维素酶活性测定对菌株进行分离筛选;根据菌株的形态特征和ITS序列分析对菌株进行鉴定;结合扫描电镜技术,分析在降解过程中降解菌对油菜秸秆物理、化学性质的影响;设置盆栽试验模拟秸秆还田以综合探究菌株对油菜秸秆的降解特性;通过纤维素酶酶谱分析及质谱检测技术获得纤维素酶基因(celI)的序列信息,克隆该基因,再利用pPICZαA质粒和毕赤酵母X33进行异源表达;经镍柱纯化后对CelI的酶学性质进行分析.[结果]从腐烂油菜秸秆田土样中共分离纯化出8株真菌,其中菌株A15的透明圈直径/菌落直径比值最大,为3.0,且滤纸酶活性和内切葡聚糖酶活性均显著高于其他菌株,分别为16.13和8.16 U·g-1,经鉴定其为绿色木霉(Trichoderma viride);接种菌株A15固体发酵28 d后,油菜秸秆失重率达29.17％,纤维素及半纤维素含量分别下降至29.41％和17.18％,经过30 d的模拟秸秆还田盆栽试验,油菜秸秆失重率达57.50％;成功表达并纯化了菌株A15来源的GH7家族纤维素酶CelI,该蛋白相对分子质量约为72×103,具有内、外切葡聚糖酶的双重活性,CelI的最适反应温度为50℃,且表现出良好的热稳定性,CelI的内切葡聚糖酶活性最适pH值为4,且Co2+、Mn2+、Ca2+对其具有促进作用,而CelI的外切葡聚糖酶活性最适pH值为5,且Mn2+对其具有显著激活作用,而Zn2+、Fe3+具有抑制作用.[结论]从腐烂油菜秸秆田土样中筛选到1株油菜秸秆降解真菌绿色木霉A15,其能高效产胞外纤维素酶,在油菜秸秆资源化利用方面具备良好的应用前景.

纤维素酶;油菜秸秆;基因克隆;异源表达;酶学特性

南京农业大学江苏省固体有机废弃物资源化研究重点实验室,江苏 南京210095

[1]李凌波;许欢欢;夏燕维;郭传旭;杨明珠;马磊;缪有志;刘东阳;张瑞福-.油菜秸秆高效降解菌的筛选及其双功能纤维素酶性质研究)[J].南京农业大学学报,2022(04):711-720

celI,CelI,GH7

油菜秸秆,双功能,功能纤维,降解菌株,降解特性,稀释涂布平板法,刚果红,红透,纤维素酶活性,酶活性测定,分离筛选,ITS,序列分析,扫描电镜技术,降解过程,化学性质,盆栽试验,试验模拟,秸秆还田,综合探究,质谱检测,技术获得,纤维素酶基因,序列信息,pPICZ,质粒,毕赤酵母,X33,异源表达,酶学性质,腐烂,田土,分离纯化,A15,菌落直径,直径比,滤纸酶活,内切葡聚糖酶,绿色木霉,Trichoderma,viride,固体发酵,失重率,半纤维素,纤维素含量,别下,白相,相对分子质量,外切葡聚糖酶,重活,反应温度,热稳定性,Co2+,Mn2+,Ca2+,Zn2+,Fe3+,秸秆降解真菌,秸秆资源化利用,基因克隆,酶学特性

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