为研究抗菌肽MPX(Mastoparan-X)对肠出血性大肠杆菌(EHEC)的体外抑菌作用及作用机理.本研究通过琼脂扩散法、最小抑菌浓度(MIC)的测定、杀菌曲线的绘制以及扫描电镜观察MPX对EHEC的抑菌效果,结果显示MPX对EHEC的抑菌圈直径为9.7 mm,大于抗菌肽PR39但小于恩诺沙星(Enro);其对EHEC的MIC为31.25 μg/mL;杀菌曲线结果显示,4MICMPX作用6h后,EHEC菌液OD600nm值降至0.1,极显著低于阴性对照组(只加入ddH2O的EHEC,下同)(P＜0.01),活菌数量降至阴性对照的千分之一(P＜0.05),且4MICMPX的抑菌效果优于抗菌肽PR39与Enro;电镜观察结果显示,MPX作用后的菌体明显变小,细菌内容物渗漏.MPX稳定性试验结果显示,酸、碱、温度、一价阳离子等对MPX的抑菌效果影响较小,二价阳离子极显著抑制MPX的抑菌活性(P＜0.01).上述结果表明,MPX在体外有较强的抑菌效果,且稳定性较强.采用BCA法测定不同浓度MPX(0.5 MIC、1 MIC、2 MIC)作用后的EHEC上清中的蛋白含量;采用SYTO 9/PI染色后经激光共聚焦显微镜观察上述不同浓度MPX作用后的EHEC菌体荧光颜色;采用苯基萘胺(NPN)探针、碘化丙啶(PI)染料和3,3-二丙基硫代二碳氰碘化物[DiSC3(5)]探针分别检测不同浓度MPX(1 MIC、2 MIC、4 MIC)作用后的EHEC菌液的荧光强度,以分析MPX对EHEC细胞膜通透性的影响.BCA结果显示,1 MIC及2 MIC MPX作用后的菌液上清蛋白含量均显著高于阴性对照组(P＜0.05);激光共聚焦试验结果显示,与阴性对照组相比,只有2 MIC MPX作用后的EHEC中的红色荧光明显增多;NPN探针和DiSC3(5)探针检测结果显示,不同浓度MPX作用后(0～2 min)EHEC的荧光强度均明显增强,其后不再变化;PI染料检测结果显示,不同浓度MPX作用后(0～4min)EHEC的荧光强度均明显增强,其后逐渐降低.上述结果表明,MPX可以破坏EHEC的外膜和细胞膜,使膜的通透性增加,进而导致细菌死亡,且该作用与MPX的浓度基本呈正相关.分别利用结晶紫染色法检测和电镜观察MPX对EHEC生物被膜(BF)形成的影响,结果显示,与阴性对照相比,1 MIC～4MIC的MPX均极显著抑制EHECBF的形成(P＜0.01、P＜0.001),且该抑制作用与MPX浓度呈正相关;电镜观察结果显示,与阴性对照组相比,1 MIC MPX作用后的EHEC BF结构松散且稀疏.以上结果表明,MPX可以通过抑制EHEC BF的形成而发挥抑菌作用.本研究为研发新型抗菌药物奠定了实验基础.

抗菌肽MPX;肠出血性大肠杆菌;体外试验

黄俊杰;赵雪芹;赵娅娅;刘双双;朱春玲;夏小静;张守平;罗维玉;徐彦召;杭柏林;孙亚伟;Hanna Fotina;胡建和;王磊

河南科技学院动物科技学院,河南 新乡 453003;Faculty of Veterinary Medicine,Sumy National Agrarian University,Sumy 40021

中国预防兽医学报

[1]黄俊杰;赵雪芹;赵娅娅;刘双双;朱春玲;夏小静;张守平;罗维玉;徐彦召;杭柏林;孙亚伟;Hanna Fotina;胡建和;王磊-.抗菌肽MPX对肠出血性大肠杆菌的体外抑菌作用及其作用机制的初步研究)[J].中国预防兽医学报,2022(07):763-770

Mastoparan,PR39,Enro,4MICMPX,SYTO,DiSC3,EHECBF

抗菌肽,肠出血性大肠杆菌,体外抑菌作用,琼脂扩散法,最小抑菌浓度,杀菌,电镜观察,抑菌效果,抑菌圈直径,恩诺沙星,线结,6h,菌液,OD600nm,ddH2O,下同,活菌数量,至阴,千分之一,菌体,内容物,渗漏,稳定性试验,阳离子,效果影响,二价,抑菌活性,BCA,上清,蛋白含量,激光共聚焦显微镜,荧光颜色,苯基,基萘,萘胺,NPN,碘化丙啶,染料,丙基,碘化物,荧光强度,细胞膜通透性,清蛋白,红色荧光,光明,明显增强,4min,外膜,结晶紫,染色法,生物被膜,新型抗菌药物,体外试验

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