为探究大黄鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)的性质,实验采用生物信息学方法对大黄鱼MBSP进行基因检索与筛选,通过分子克隆得到大黄鱼MBSP编码区全长cDNA并构建毕赤酵母表达系统得到重组蛋白质(Lc-rMBSP),分析Lc-rMBSP的酶学性质和二级结构并通过同源建模分析Lc-MBSP的三级结构.结果显示,大黄鱼肌原纤维蛋白中存在MBSP,在55°C下活性最高.大黄鱼基因组中注释为类胰蛋白酶的基因有16条,对这些基因与淡水鱼MBSP进行系统进化树分析和多序列比对,得到同源性较高的基因序列(Lc-MBSP).Lc-MBSP编码区全长735 bp,共编码244个氨基酸残基.通过毕赤酵母重组表达,分离纯化得到分子量约28 ku的重组蛋白质Lc-rMBSP.表达蛋白的最适温度和pH分别为50°C和8.0.圆二色谱分析表明,温度对Lc-rMBSP二级结构具有较大的影响.Lc-rMBSP在较宽的温度范围内(40～60°C)对MHC具有较高的水解活性.Lc-rMBSP的最适底物为Boc-Leu-Lys-Arg-MCA,并且特异性切割羧基侧的精氨酸残基,而不分解赖氨酸残基.通过同源建模得到Lc-MBSP的三维结构,催化三联体由保守的His-61、Asp-105和Ser-198构成,其底物结合口袋(Ser-192、Gly-215和Ser-225)与类胰蛋白酶的略有不同,这种差异可能是导致Lc-rMBSP与其他胰蛋白酶酶学性质不同的主要原因.本研究可为海水鱼MBSP的研究提供理论参考.

大黄鱼;肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶;基因克隆;性质分析;圆二色谱;同源建模

刘海燕;杨汝晴;陈玉磊;张凌晶;孙乐常;刘光明;曹敏杰

集美大学海洋食品与生物工程学院,福建 厦门 361021

水产学报

[1]刘海燕;杨汝晴;陈玉磊;张凌晶;孙乐常;刘光明;曹敏杰-.大黄鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的克隆、表达及性质)[J].水产学报,2022(07):1154-1166

肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶,MBSP,rMBSP

大黄鱼,生物信息学方法,分子克隆,编码区,全长,cDNA,毕赤酵母,酵母表达系统,重组蛋白,Lc,酶学性质,二级结构,同源建模,建模分析,三级结构,肌原纤维蛋白,类胰蛋白酶,淡水鱼,系统进化树分析,多序列比对,同源性,基因序列,bp,氨基酸残基,重组表达,分离纯化,分子量,ku,圆二色谱,色谱分析,MHC,水解活性,底物,Boc,Leu,Lys,Arg,MCA,羧基,精氨酸,不分,赖氨酸,三维结构,三联体,His,Asp,Ser,合口,口袋,Gly,略有不同,种差,海水鱼,基因克隆,性质分析

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