目的:探讨抑制环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)表达对软骨细胞发育成熟的影响及其作用机制.方法:①分析温度对SV40病毒大T抗原介导永生化小鼠软骨细胞(mouse chondrocytes immortalized by SV40 large T antigen,MCT)发育成熟的影响.将MCT在温度32℃、CO2浓度8％的细胞培养箱内进行培养,待MCT汇合率至80％时,分别置于32℃下(32℃培养组)和37℃下(37℃培养组)继续培养.培养72 h后,采用相差倒置显微镜观察细胞形态学变化;采用CIAS大恒细胞图像分析系统测量细胞长径、短径,并计算细胞体积;提取各复孔中MCT的RNA,逆转录后采用实时定量PCR检测MCT中COX-2、胶原蛋白α-1(X)[Collagen alpha-1(X)chain,COL10A1]的mRNA表达水平;提取各复孔中MCT的总蛋白,采用蛋白质印迹法检测MCT中COX-2、COL10A1的蛋白表达水平.②筛选COX-2抑制剂NS-398的最佳抑制浓度.将MCT在温度32℃、CO2浓度8％的细胞培养箱内进行培养,待MCT汇合率至80％时,按照NS-398终浓度为0.2μmol·L-1、1μmol·L-1、2μmol·L-1、10μmol·L-1、20μmol·L-1、25μmol·L-1、30μmol·L-1、40μmol·L-1、50μmol·L-1、60μmol·L-1将MCT分为10个干预组,分别加入等体积不同浓度的NS-398,空白对照组加入等体积的二甲亚砜.于37℃下培养24 h后,提取各复孔中MCT的RNA,逆转录后采用实时定量PCR检测MCT中COX-2的mRNA表达量,比较和筛选NS-398对COX-2表达的最佳抑制浓度.③分析NS-398最佳抑制浓度对MCT发育成熟的影响.以②中NS-398最低浓度为对照,分析NS-398最佳抑制浓度对MCT发育成熟的影响.将MCT在温度32℃、CO2浓度8％的细胞培养箱内进行培养,待MCT汇合率至80％时,按照NS-398终浓度为0.2μmol·L-1、40μmol·L-1将MCT分为0.2μmol·L-1 NS-398干预组和40μmol·L-1 NS-398干预组,分别加入等体积不同浓度的NS-398,移至温度37℃、CO2浓度8％的细胞培养箱内继续培养.培养72 h后,采用①中方法测量细胞体积,检测MCT中COX-2、COL10A1的mRNA和蛋白表达水平.采用Person相关分析法分析COX-2 mRNA表达量、COL10A1 mRNA表达量与MCT细胞体积的相关性.结果:①温度对MCT发育成熟的影响.32℃培养组MCT表现为持续增殖状态,37℃培养组MCT表现为肥大状态.37℃培养组MCT细胞体积大于32℃培养组[(2336.19±24.69)μm3,(1195.27±13.28)μm3,t=70.488,P=0.000],COX-2、COL10A1的mRNA和蛋白表达量均高于32℃培养组(COX-2:2.09±0.26,1.33±0.35,t=3.019,P=0.039;2.37±0.26,1.58±0.19,t=4.249,P=0.013;COL10A1:2.32±0.34,1.41±0.21,t=3.944,P=0.017;2.56±0.28,1.59±0.17,t=5.129,P=0.007).②COX-2抑制剂NS-398的最佳抑制浓度.37℃下培养24 h后,11组MCT中COX-2的mRNA表达量比较,差异有统计学意义(1.00±0.11,0.89±0.09,0.81±0.08,1.24±0.13,0.63±0.06,0.69±0.07,0.71±0.07,0.70±0.06,0.43±0.04,0.85±0.09,0.84±0.08,F=38.074,P=0.000).40μmol·L-1 NS-398干预组MCT中COX-2的mRNA表达量低于对照组和其他浓度NS-398干预组(P=0.001,P=0.001,P=0.001,P=0.001,P=0.002,P=0.001,P=0.001,P=0.001,P=0.001,P=0.001).③NS-398最佳抑制浓度对MCT发育成熟影响的分析结果.培养72 h后,40μmol·L-1 NS-398干预组MCT细胞体积小于0.2μmol·L-1 NS-398干预组[(995.64±10.98)μm3,(2011.07±20.52)μm3,t=70.488,P=0.000],COX-2、COL10A1的mRNA和蛋白表达量均低于0.2μmol·L-1 NS-398干预组(COX-2:0.39±0.04,0.99±0.09,t=15.988,P=0.000;1.53±0.16,3.97±0.40,t=9.810,P=0.000;COL10A1:0.49±0.05,1.01±0.11,t=11.258,P=0.000;1.09±0.12,2.74±0.29,t=9.106,P=0.001).Pearson相关分析结果表明,COX-2 mRNA表达量与COL10A1 mRNA表达量、COX-2 mRNA表达量与MCT细胞体积、COL10A1 mRNA表达量与MCT细胞体积均呈正相关(r=0.552,P=0.011;r=0.658,P=0.001;r=0.590,P=0.003).结论:抑制COX-2表达能够抑制软骨细胞发育成熟,其作用机制与COL10A1表达下调有关.

内生软骨瘤病;软骨细胞;环氧合酶2;环氧合酶2抑制剂

王灿;司文腾

郑州市骨科医院,河南 郑州 450052

中医正骨

[1]王灿;司文腾-.抑制环氧合酶-2表达对软骨细胞发育成熟的影响)[J].中医正骨,2022(11):1-6

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