目的:建立一种基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白（CRISPR/Cas13a）的乙型肝炎病毒（HBV）共价闭合环状DNA（HBV cccDNA）检测方法。方法:提取2017年6月至2020年10月于首都医科大学附属北京佑安医院就诊的4例乙型肝炎患者肝脏总DNA后，使用Hind Ⅲ内切酶和质粒安全性ATP依赖DNA酶（PSAD）分别进行酶切；根据松弛环状DNA（rcDNA）和cccDNA的结构差异，设计特异性扩增HBV cccDNA的引物，对酶切后的产物进行滚环扩增（RCA）和PCR扩增；并筛选crRNA，建立基于CRISPR/Cas13a技术的HBV cccDNA检测新方法。结果:利用α-1-抗胰蛋白酶（A1AT）和HBV表面抗原（HBsAg）引物对双重酶切后的产物进行扩增，验证产物中HBV基因组的存在；利用HBV cccDNA和HBV rcDNA引物对PSDA酶切后的产物扩增，验证了产物中只存在HBV cccDNA；利用RCA后的阳性样本作为模板梯度稀释，然后进行PCR扩增转录后使用CRISPR/Cas13a检测，计算出检测下限为10拷贝/μl。结论:本研究建立了RCA-PCR-CRISPR-Cas13a的新型检测方法，可对HBV cccDNA进行高灵敏度和高特异性检测，为乙型肝炎患者抗病毒治疗评估、治疗终点的确定以及调整治疗方案提供了有效的监测手段。

肝炎病毒，乙型;共价闭合环状DNA;规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白;微滴数字聚合酶链反应;荧光定量聚合酶链反应

王俊文;田原;范子豪;徐玲;高耀;曹亚玲;潘桢桢;张向颖;宋岩;任锋

100022　北京，北京市垂杨柳医院检验科;100069　北京，首都医科大学附属北京佑安医院/北京肝病研究所

中华实验和临床感染病杂志（电子版）

[1]王俊文;田原;范子豪;徐玲;高耀;曹亚玲;潘桢桢;张向颖;宋岩;任锋-.基于规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白技术检测乙型肝炎病毒共价闭合环状DNA方法的建立)[J].中华实验和临床感染病杂志（电子版）,2022(05):320-327

规律成簇的间隔短回文重复序列及其相关蛋白,rcDNA,微滴数字聚合酶链反应

乙型肝炎病毒,共价闭,闭合环,CRISPR,Cas13a,HBV,cccDNA,首都医科大学,乙型肝炎患者,Hind,内切,质粒,ATP,PSAD,松弛,结构差异,引物,滚环扩增,RCA,crRNA,胰蛋白酶,A1AT,表面抗原,HBsAg,PSDA,阳性样本,梯度稀释,检测下限,拷贝,高灵敏度,特异性检测,抗病毒治疗,治疗评估,治疗终点,调整治疗,监测手段,荧光定量聚合酶链反应

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